实时荧光定量PCR技术原理
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Ct=-klgX0+b
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数
起始拷贝数越多，Ct值越小。
12
标准曲线 (standard curve)
10 6 105
104
Baidu Nhomakorabea
103
102
未知
.
10
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
荧光信号强度与反应体系中 所有双链DNA分子成正比。
16
SYBR Green I 工作原理
5’
3’ SG SG
SG
3’
5’ SG
5’
SG
3Ex’ citation
SG
SG
3’
SG
Emission5’
-- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。 -- 延伸结束时，采集荧光信号。
17
SYBR Green I
优点： ❖ 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物
❖ 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性
缺点：
❖ SYBR Green与所有双链 DNA结合
-- 引物二聚体或错误扩增产 物造成假阳性
-- 只能检测单一模板，无法 进行多重检测
需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。
18
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融解曲线 (dissociation curve)
确认PCR反应产物的特异性
原始图谱
对数图谱
将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
19
融解曲线分析
-- 非特异性产物 -- 引物二聚体
20
Taqman 工作原理
RQ
R Reporter Q Quencher
❖ 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团）
4
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•理想的PCR反应： N=N0*2n
PCR：基本原理
S形曲线，具有平台效应
•实际的PCR反应： N=N0* (1+E)n
•N0：初始模板量 •N：第n次循环后的产物量 •n：扩增反应的循环次数 E：扩增效率
5
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传统PCR检测
11
Ct值可以确定初始模板量？
Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n个循环的总信号
=本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度
当循环次数n=Ct时 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)
Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到
设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。
起始模板量 基线 阈值 Ct值
10
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Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值的特点： ▪相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 很大，但Ct值相对固定； ▪Ct值则极具重现性
❖ 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。
❖ 聚合酶的5’外切酶活性 ❖ 报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。
Real-time qPCR的解析方法
3
PCR：基本原理
基本要素： • Template • Primers • DNA polymerase • dNTP, N=A,G,C or T
Denaturation: 94 – 96°C
Annealing: 50 – 65°C
Extension: 70 – 75°C
基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值
9
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Ct 值(Cycle Threshold)
与普通PCR的对比
同一个样本进行96次重复
传统PCR检测
Real time PCR 检测
❖ 传统PCR--终点检测：
❖ Real time PCR--起点检测：
-- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 起点量是样本中起始的DNA量
-- “生成了500，0000，0000个拷贝” -- “加入了500个拷贝”
-- 不恒定，误差大
-- 具有重现性，误差小
6
Real-time qPCR
荧光基团 激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
7
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扩增曲线（primary curve）
线性图
对数图
扩增曲线：
随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。 每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩 增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。
纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
8
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荧光阈值（threshold）
探针标记： ✓水解探针： TaqMan ✓非水解探针：Molecular beacon
15
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SYBR Green I 工作原理
SYBR Green I 是一种与双链DNA 小沟结合的荧光染料。
SYBR Green I只与双链DNA结合才 能发出荧光。
荧光信号与双链DNA分子数成正 比，随着扩增产物增加而增加。
大家好
1
实时荧光定量PCR技术 原理、应用及实践
Real tim(ReealQtimueaQnutainttaitatitivveePPCRC)R
2
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1 2
3
4
主要内容
Real-time qPCR的基本概念 Real-time qPCR的定量原理 Real-time qPCR的检测方法
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
13
标准曲线分析
y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性 -- 线性的标准曲线：相关系数R2 -- 扩增效率：
扩增效率(E)=10-1/斜率-1
14
荧光定量PCR检测方法
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染料标记： ✓ SYBR Green I
lgX0与Ct值呈线性关系 根据Ct值可以计算出样本中起始模板所含有的拷贝数
起始拷贝数越多，Ct值越小。
12
标准曲线 (standard curve)
10 6 105
104
Baidu Nhomakorabea
103
102
未知
.
10
Rn vs. Cycle number-- 扩增曲线
LogDNA vs. Ct -- 标准曲线
荧光信号强度与反应体系中 所有双链DNA分子成正比。
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SYBR Green I 工作原理
5’
3’ SG SG
SG
3’
5’ SG
5’
SG
3Ex’ citation
SG
SG
3’
SG
Emission5’
-- 变性时，DNA双链分开，无荧光信号。 -- 延伸结束时，采集荧光信号。
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SYBR Green I
优点： ❖ 使用方便，成本低 -- 仅需设计两个引物
❖ 通用性好 -- 对DNA模板没有选择性
缺点：
❖ SYBR Green与所有双链 DNA结合
-- 引物二聚体或错误扩增产 物造成假阳性
-- 只能检测单一模板，无法 进行多重检测
需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。
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融解曲线 (dissociation curve)
确认PCR反应产物的特异性
原始图谱
对数图谱
将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT)
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融解曲线分析
-- 非特异性产物 -- 引物二聚体
20
Taqman 工作原理
RQ
R Reporter Q Quencher
❖ 探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，5’ 报告基团、3’淬灭基团）
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•理想的PCR反应： N=N0*2n
PCR：基本原理
S形曲线，具有平台效应
•实际的PCR反应： N=N0* (1+E)n
•N0：初始模板量 •N：第n次循环后的产物量 •n：扩增反应的循环次数 E：扩增效率
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传统PCR检测
11
Ct值可以确定初始模板量？
Rn=RB+ X0 (1+E)N * RS 第n个循环的总信号
=本底信号 + 起始DNA数目 * PCR扩增效率 * 单位信号强度
当循环次数n=Ct时 RCt=RB+ X0 (1+E)Ct * RS 两边同时取对数得: lg(RCt-RB)=lgX0+Ctlg(1+E)+lgRS Ct=-lgX0/lg(1+E)+ lg(RCt-RB)-lgRS/lg(1+E)
Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到
设定的阈值时，荧光值所对应的PCR循环次数。
起始模板量 基线 阈值 Ct值
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Ct 值(Cycle Threshold)
Ct值的特点： ▪相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 很大，但Ct值相对固定； ▪Ct值则极具重现性
❖ 完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团Q淬灭， 没有荧光产生。
❖ 聚合酶的5’外切酶活性 ❖ 报告基团R与淬灭基团Q分离，发射荧光。
Real-time qPCR的解析方法
3
PCR：基本原理
基本要素： • Template • Primers • DNA polymerase • dNTP, N=A,G,C or T
Denaturation: 94 – 96°C
Annealing: 50 – 65°C
Extension: 70 – 75°C
基线(baseline)：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信号 荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 -- 手动设置：大于样本的荧光背景值
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Ct 值(Cycle Threshold)
与普通PCR的对比
同一个样本进行96次重复
传统PCR检测
Real time PCR 检测
❖ 传统PCR--终点检测：
❖ Real time PCR--起点检测：
-- 终点产物量经过PCR放大的DNA量 -- 起点量是样本中起始的DNA量
-- “生成了500，0000，0000个拷贝” -- “加入了500个拷贝”
-- 不恒定，误差大
-- 具有重现性，误差小
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Real-time qPCR
荧光基团 激发光
发射光
-- 在PCR反应体系中加入荧光基团。 -- 荧光基团在激发光的作用下，产生波长更长的发射光。 -- 利用荧光信号的变化动态监测整个反应过程。
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扩增曲线（primary curve）
线性图
对数图
扩增曲线：
随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。 每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩 增产物量的变化，从而得到扩增曲线图。
纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）
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荧光阈值（threshold）
探针标记： ✓水解探针： TaqMan ✓非水解探针：Molecular beacon
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SYBR Green I 工作原理
SYBR Green I 是一种与双链DNA 小沟结合的荧光染料。
SYBR Green I只与双链DNA结合才 能发出荧光。
荧光信号与双链DNA分子数成正 比，随着扩增产物增加而增加。
大家好
1
实时荧光定量PCR技术 原理、应用及实践
Real tim(ReealQtimueaQnutainttaitatitivveePPCRC)R
2
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1 2
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主要内容
Real-time qPCR的基本概念 Real-time qPCR的定量原理 Real-time qPCR的检测方法
标准曲线分析 -- 对已知或未知样本进行系列浓度梯度稀释
13
标准曲线分析
y = -ax+b 测定荧光定量PCR反应的有效性 -- 线性的标准曲线：相关系数R2 -- 扩增效率：
扩增效率(E)=10-1/斜率-1
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荧光定量PCR检测方法
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染料标记： ✓ SYBR Green I