核酸分离纯化
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的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲 液中需加核酸酶抑制剂。
其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子 的污染应降低到最低程度；
2020/6/15
4
DNA酶（DNase）抑制剂
1）金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活， 因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活 性，如EDTA-Na2等。 2）阴离于型表面活性剂：
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一 级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大 分子结合的方式。
2 分离核酸原则： ①温度不要过高； ②控制一定的pH值范围(pH值5-9); ③保持一定的离子强度; ④减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。
2020/6/15
3
(二) 防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中
2020/6/15
15
使用酚时应注意
1.酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现 粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例 如醌等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为 氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
2.酚具有很强的结合水的能力，因此在使用前 需要用pH8.0的10mM Tris-HCl饱和，之后加入抗氧 化剂β-巯基乙醇和8-羟基喹啉。
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母 组织、培养细胞 细菌、酵母
11
细胞的破碎
(1) 高速组织捣碎机捣碎
(2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
2020/6/15
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃2 h。
2020/6/15
8
对内源性RNase：
选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及 强烈的胍类变性剂）。
如：Trizol内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎 细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂 可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、 水解与灭活。
对外源性的可用DEPC。
2020/6/15
7
常用的RNase抑制剂：
=
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3
=
DEPC(焦碳酸二乙酯)
O
粘性液体，高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶 活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。很强 的核酸酶抑制剂。与蛋白的His结合使蛋白变性。
使用注意：
易降解，保存在4 ℃或液氮中；
2020/6/15
14
2、酚/氯仿抽提： 酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并
对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相(DNA)分 层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除 植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。
2020/6/15
9
百度文库
分离提取核酸的主要步骤
DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外）， 因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、 释放核酸。
机械法与非机械法（非机械法中溶胞法 是应用最广泛的方法）
2020/6/15
10
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法
Ⅲ化学法
2020/6/15
各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外， 还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电 荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
2020/6/15
5
RNA酶(RNase)抑制剂 RNase分布广泛，极易污染样品，而且耐高 温、耐酸、耐碱，不易失活。
RNase除胞内（内源性）还广泛存在于人的 皮肤、唾液、汗液及周围的环境中（外源性）。
RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键； RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非 常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。 Rnase不需要二价阳离子激活。
2020/6/15
6
去除RNase的污染及强有力地抑制其活性 是RNA制备成功与否的关键。
必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽 可能地灭活胞内RNase的活性。
2020/6/15
12
核酸的分离与纯化 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 它物质分离。 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、不需要的核酸分子、试剂和溶液。 核蛋白的解聚 核酸与蛋白质的结合力主要是静电吸引力(核酸 与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
2020/6/15
1
核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首 先需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
分子生物学与疾病诊断。
2020/6/15
2
核酸分离、纯化原则
(一) 保持核酸分子一级结构的完整性 1 意义
3.酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作 时应戴手套。
2020/6/15
16
核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
2020/6/15
17
核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离 子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂 中不溶解，也不会被有机溶剂变性。
2020/6/15
13
常用DNA提取方法 1、加入10倍体积的缓冲液：
10mM Tris-HCl(pH7.4)；150mM NaCl；10mM EDTA； 0.5% SDS。
NaCl破坏核酸-蛋白质间的静电引力，使氢键 破坏，核蛋白解聚；EDTA破坏细胞膜、敖合Ca2+， 使DNase失活；SDS可破坏细胞膜、抑制核酸酶， 可使核酸从蛋白质上游离出来。
所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲 液中需加核酸酶抑制剂。
其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子 的污染应降低到最低程度；
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DNA酶（DNase）抑制剂
1）金属离子螯合剂：
DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活， 因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活 性，如EDTA-Na2等。 2）阴离于型表面活性剂：
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一 级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大 分子结合的方式。
2 分离核酸原则： ①温度不要过高； ②控制一定的pH值范围(pH值5-9); ③保持一定的离子强度; ④减少物理因素对核酸降解的机械剪切力。
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(二) 防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中
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使用酚时应注意
1.酚通常是透明无色的结晶，如果酚结晶呈现 粉红色或黄色，表明其中含有酚的氧化产物，例 如醌等。变色的酚不能用于核酸抽提实验，因为 氧化物可破坏核酸的磷酸二酯键。
2.酚具有很强的结合水的能力，因此在使用前 需要用pH8.0的10mM Tris-HCl饱和，之后加入抗氧 化剂β-巯基乙醇和8-羟基喹啉。
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母 组织、培养细胞 细菌、酵母
11
细胞的破碎
(1) 高速组织捣碎机捣碎
(2) 玻璃匀浆器匀浆 (3) 超声波处理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化学处理法(SDS、LDS，吐温80等） (6) 生化法（溶菌酶、纤维素酶等）
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
2020/6/15
贮存液浓度（mol/L)
1 3 (pH5.2) 3 (pH5.2)
10 5 8
提RNA时，0.1% DEPC浸泡器皿37℃2 h。
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对内源性RNase：
选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及 强烈的胍类变性剂）。
如：Trizol内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎 细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
加入β-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂 可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、 水解与灭活。
对外源性的可用DEPC。
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常用的RNase抑制剂：
=
O
C-CH2-CH3 O
C-CH2-CH3
=
DEPC(焦碳酸二乙酯)
O
粘性液体，高度活化的烷基化试剂，破坏RNA酶 活性。用来灭活缓冲液或器皿中的RNA酶。很强 的核酸酶抑制剂。与蛋白的His结合使蛋白变性。
使用注意：
易降解，保存在4 ℃或液氮中；
2020/6/15
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2、酚/氯仿抽提： 酚/氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并
对核酸酶有抑制作用。
氯仿比重大，能加速有机相与水相(DNA)分 层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除 植物色素和蔗糖的作用。
在酚/氯仿抽提核酸提取液时，需要振摇，为 防止起泡和促使水相与有机相的分离，再加上一 定量的异戊醇（酚：氯：异戊醉=25：24：1）。
2020/6/15
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百度文库
分离提取核酸的主要步骤
DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外）， 因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、 释放核酸。
机械法与非机械法（非机械法中溶胞法 是应用最广泛的方法）
2020/6/15
10
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法
Ⅲ化学法
2020/6/15
各种组织细胞破碎方法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外， 还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电 荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。
2020/6/15
5
RNA酶(RNase)抑制剂 RNase分布广泛，极易污染样品，而且耐高 温、耐酸、耐碱，不易失活。
RNase除胞内（内源性）还广泛存在于人的 皮肤、唾液、汗液及周围的环境中（外源性）。
RNase具有水解核糖残基和磷酸二酯键； RNase分子结构中的二硫键使其生物学活性非 常稳定，去除变性剂后，RNase的活性又可恢复。 Rnase不需要二价阳离子激活。
2020/6/15
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去除RNase的污染及强有力地抑制其活性 是RNA制备成功与否的关键。
必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽 可能地灭活胞内RNase的活性。
2020/6/15
12
核酸的分离与纯化 将含有核酸分子复杂复合物中，将核酸与其 它物质分离。 非核酸的大分子污染物（蛋白质、多糖和脂 类分子）、不需要的核酸分子、试剂和溶液。 核蛋白的解聚 核酸与蛋白质的结合力主要是静电吸引力(核酸 与碱性蛋白的结合)、氢键和非极性的范德华力。 分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白 质分开，同时避免核酸降解。
2020/6/15
1
核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首 先需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
分子生物学与疾病诊断。
2020/6/15
2
核酸分离、纯化原则
(一) 保持核酸分子一级结构的完整性 1 意义
3.酚腐蚀性很强，并可引起严重的灼伤，操作 时应戴手套。
2020/6/15
16
核酸的沉淀
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
2020/6/15
17
核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离 子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂 中不溶解，也不会被有机溶剂变性。
2020/6/15
13
常用DNA提取方法 1、加入10倍体积的缓冲液：
10mM Tris-HCl(pH7.4)；150mM NaCl；10mM EDTA； 0.5% SDS。
NaCl破坏核酸-蛋白质间的静电引力，使氢键 破坏，核蛋白解聚；EDTA破坏细胞膜、敖合Ca2+， 使DNase失活；SDS可破坏细胞膜、抑制核酸酶， 可使核酸从蛋白质上游离出来。