生物制药工艺学思考题及答案

抗生素发酵生产工艺

1. 青霉素发酵工艺的建立对抗生素工业有何意义？

青霉素是发现最早，最卓越的一种B-内酰胺类抗生素，它是抗生素工业的首要产品，青霉素是各种半合成抗生素的原料。青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对革兰氏阴性菌无效。青霉素经过扩环后，形成头孢菌素母核，成为半合成头孢菌素的原料。

2. 如何根据青霉素生产菌特性进行发酵过程控制？

青霉素在深层培养条件下，经历7个不同的时期，每个时期有其菌体形态特性，在规定时间取样，通过显镜检查这些形态变化，用于工程控制。

第一期：分生孢子萌发，形成芽管，原生质未分化，具有小泡。

第二期：菌丝繁殖，原生质体具有嗜碱性，类脂肪小颗粒。

第三期：形成脂肪包含体，积累储蓄物，没有空洞，嗜碱性很强。

第四期：脂肪包含体形成小滴并减少，中小空泡，原生质体嗜碱性减弱，开始产生抗生素。

第五期：形成大空泡，有中性染色大颗粒，菌丝呈桶状。脂肪包含体消失，青霉素产量提高。

第六期：出现个别自溶细胞，细胞内无颗粒，仍然桶状，释放游离氨，pH上升。

第七期：菌丝完全自溶，仅有空细胞壁。一到四期为菌丝生长期，三期的菌体适宜为种子。

四到五期为生产期，生产能力最强，通过工艺措施，延长此期，获得高产。在第六期到来之前发束发酵。

3. 青霉素发酵工程的控制原理及其关键点是什么？

控制原理：发酵过程需连续流加葡萄糖，硫酸铵以及前提物质苯乙酸盐，补糖率是最关键的控制指标，不同时期分段控制。在青霉素的生产中，及时调节各个因素减少对产量的影响，如培养基，补充碳源，氮源，无机盐流加控制，添加前体等；控制适宜的温度和ph，菌体浓度。最后要注意消沫，影响呼吸代谢。

4. 青霉素提炼工艺中采用了哪些单元操作？

青霉素不稳定，发酵液预处理、提取和精制过程要条件温和、快速，防止降解。提炼工艺包括如下单元操作：

①预处理与过滤：在于浓缩青霉素，除去大部分杂质，改变发酵液的流变学特征，便于后续的分离纯化过程。

②萃取：其原理是青霉素游离酸易溶于有机溶剂，而青霉素易溶于水。

③脱色：萃取液中添加活性炭，除去色素，热源，过滤，除去活性炭。

④结晶：青霉素钾盐在乙酸丁酯中溶解度很小，在乙酸丁酯萃取液中加入乙酸钾-乙醇溶液，青霉素钾盐可直接结晶析出。

氨基酸发酵工艺

1. 如何对谷氨酸发酵工艺过程进行调控？

发酵过程流加铵盐、尿素、氨水等氮源，补充NH4+；生物素适量控制在2-5μg/L；pH 控制在中性或微碱性；供氧充足；磷酸盐适量。

2. 氨基酸生产菌有什么特性，为什么？

L-谷氨酸发酵微生物的优良菌株多在棒状杆菌属、小短杆菌属、节杆菌属和短杆菌属中。具有下述共同特性：①细胞形态为短杆至棒状；②无鞭毛，不运动；③不形成芽孢；④革兰氏阳性；⑤生物素缺陷型；⑥三羧酸循环、戊糖磷酸途径突变；⑦在通气培养条件下产生大量L-谷氨酸。

3. 生物素在谷氨酸发酵过程中的作用是什么？

生物素是不饱和脂肪酸合成过程中所需的乙酰CoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通透性，解除其对谷氨酸脱氢酶的抑制，源源不断生产谷氨酸。

维生素发酵生产工艺

1. 比较分析现行维生素C的两种生产工艺过程及本质区别，有什么优势？

现行的维生素c生产工艺过程有：莱氏化学合成法和两步发酵法。

莱氏化学合成法：D-葡萄糖为原料，进过催化氢化生成D-山梨醇，然后生物氧化转变为L-山梨糖，酸性液中丙酮化，对α-β-二仲醇进行保护。L-山梨糖高锰酸钾在碱性溶液中氧化为二丙酮-2-酮-L-古龙酸，除去丙酮，内酯化和烯醇化得到L-抗坏血酸。整个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变。

两部发酵法：①催化氢化：催化氢化D-葡萄糖，控制压力，在氢做还原剂、镍做催化剂的条件下，将醛基还原成醇基，从而制备D-山梨醇。②第一部发酵：D-山梨醇C2位羟基氧化为羰基，其他基团不变，微生物转化得L-山梨糖。③第二部发酵：L-山梨糖到2-酮基-L-古龙酸需要将C1位醇基氧化为羧基，保持其他基团不发生变化。

其中两步发酵法更具有优势。原因如下：①以生物氧化代替化学氧化简化了生产工艺。

②省略了丙酮化反应步骤，节省了丙酮、硫酸等大量化工原料和其防爆设备，节约了成本，有利于安全生产。③三废和污染较小。④提高了生产能力。

2.维生素C的生产工艺中，手性中心是如何实现的？

维生素C分子中含有两个手性碳原子，故有四个光学异构体。其中L(+)-抗坏血酸括性最高，D（-）-异抗坏血酸活性仅为其20％，工业上将其作为食品抗氧剂。D(-)-抗坏血酸和L(+)-异抗坏血酸几乎无活性。

3. 在未来，一步发酵能取代两部发酵，成为维生素生产的主流工艺吗，为什么？

一步法发酵对工业菌株的山梨醇/糖旁路代谢途径进行敲除。与原始菌株比较，发现单菌发酵24h后，培养基中剩余的山梨醇糖含量基本保持恒定，NSR缺失株相对于原始菌株残糖量提高了85.9%。

基因工程制药工艺

1. 工程菌与宿主菌对培养基要求有何不同，为什么？

碳源：大肠杆菌以蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源；酵母利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质为碳源。

氮源：不同工程菌对氮源利用能力差异大，具有很高的选择性。大肠杆菌利用酵母粉等大分子有机氮源；酵母利用氨基酸为氮源。

选择剂：基因工程大肠杆菌含有抗生素抗性基因，抗生素作为选择剂；基因工程酵母菌常用氨基酸营养缺陷型。

2. 影响工程菌培养工艺的主要参数是什么？如何优化控制？

温度：生长与生产温度不一致。较高温度表达量大，易形成包涵体。策略：较低温度下有利于表达可溶性蛋白质。对于热敏感的蛋白质，高温会降解破坏。策略：生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。

pH：了解发酵过程中各个阶段的适宜pH以后，进一步设法控制pH在合适的范围

内。分阶段控制pH：根据试验结果来确定生长最适pH和产物最适pH，以达到最佳生产。

溶解氧：从供应量和需要量（菌体生长、质粒稳定性、产物积累）二个方面考虑，使之需氧不超过设备的供氧能力，在临界溶解氧浓度之上。