青霉素结合蛋白

青霉素结合蛋白
青霉素结合蛋白(PBPs)是广泛存有于细菌表面的一种膜蛋白，是β_内酞胺类抗生素的主要作用靶位。

不同细菌其种类及含量均不相同。

但各种菌种的PBPs又有很多类似的结构与功能，在细菌生长、繁殖中发挥重要作用。

PBPs结构与数量的改变是产生细菌耐药的一个重要机制。

现今，各类抗生素虽种类繁多，但在耐药菌的治疗中仍缺乏有效手段。

所以近年来围绕PBPs展开了大量的研究工作，试图从分子结构与基因水平理解PBPs，探求细菌耐药的机制，企图获得更有效的治疗手段。

1PBPs研究简史及基本概念
即使临床上很早就开始应用青霉素，但到20世纪50年代，人们才理解到青霉素是通过干扰细菌的表面结构而起作用的。

60年代，细菌细胞壁的结构被阐明，为人们理解青霉素作用机制及PBPs奠定了基础。

1972年Suginak.Blumberg和Strominge：发现青霉素结合蛋白，用放射性同位素标记的青霉素能够标出细菌表面的PBPs，但后来的研究发现并非所有PBP均是青霉素作用的致命靶位。

所有细菌都含有多种青霉素结合蛋白，不同菌属其PBPs含量、种类各不相同，不同的抗生素通过与不同的PBP蛋白结合而产生不同的抗菌活性。

所以，与不同PBP 结合的抗生素可联合应用，往往产生协同作用。

每个菌种都有一套特异的PBPs，称PBPs谱。

在一种菌种中PBPs按分子量大小排序，分别称PBPI,PBP2,PBP3......。

PBPl为分子量最大的一种。

不同菌属PBPs的生理功能很相近，而且分子结构上也有其相关及相似性。

PBPs含量很少，仅占细胞膜蛋白总量的1%，不同PBP含量变化很大，如大肠杆菌中高分子的PBPI,PBP2和PBP3量很少，而低分子PBPS和PBP6却占PBPs量的70%—90%。

各种PBP与抗生素亲和力相差亦很大。

亲和力大小一般用。

表示;指使-青霉素G结合减少50%时该抗生素浓度，其值越高，示药物亲和力越小。

研究PBPs的方法与技术持续地发展。

比如现已用分子生物学方法研
究PBPs分子结构，基因构成与变异，通过基因重组研究PBPs功能等。

但传统的方法仍是研究的基本方法，比如用超声技术粉碎细菌，离心
分离胞膜，用TritonX-100从胞膜中分离PBPs,用一青霉素G标记PBPs，用胶体电泳分离PBPs等。

2各种青霉素结合蛋白研究进展
PBPs在不同菌种中各不相同，但对其分子结构，生理功能的研究发现每种菌种均有特异PBPs,PBPs的生理功能直接影响与其结合的抗生素
的抗菌活性，这方面的研究已积累了大量的资料.但某些问题及研究结
果的意义仍不十分清楚，为了研究者能迅速了解这方面研究进展，以
下以大肠杆菌和肺炎球菌为例说明研究近况。

对大肠杆菌PBPs的研究最早展开，也是研究最多的，比较具有代表性。

大肠杆菌含6种PBP，依次为PBPI,PBP2,PBP3.PBP4,PBPS,PBP6。

大肠杆菌PBP1主要功能为维持细胞形态,可分成PBP1a,PBPlbs两部分。

PBPlbs主要分布于细胞内膜.亦有少部分分布于细胞外膜①。

是细菌生长的重要蛋白，与抗生素结合可致细菌快速溶解.最近研究表明，PBP1b是一种球蛋白，具有2个密切相关的酶活性区，一为转肚酶活性区(转肚反应是细胞壁合成中的限速反应)，另一为转糖酶活性区②。

PBPla具有PBPlbs替代酶的作用。

缺乏PBPla的变异株能够存活，说
明PBPla为细菌生长非必需蛋白.用仅有PBPla,PBPlbs基因或特异性
分裂基因ftsA,ftsQ,pbpB,ftsZ变异的细菌株来研究PBPa与PBP1bs
的功能时发现：PBPla不能独立维持细胞完整性，需与PBP2,PBP3及ftsQ基因产物一起才能维持细菌存活.而PBPIbs显然较PBPla有更强
的生物合成功能，在缺乏PBP1a,PBP2,PBP3和ftsQ基因产物时变异株
细菌仍能存活，在细菌分裂中，PBPlbs也起着相当作用，与肤聚糖的
合成相关③④。

PBP2能维持大肠杆菌的张力，使菌体保持杆棒状。

PBP2仅占PBPs的1%。

美西林、克拉维酸和硫霉素与PBP2有高度亲和力。

与PBP2结合
后，可使细菌变成园球体，终致溶解、死亡。

有实验表明在缺乏PBP2
基因的菌株中，如能使PPGPP大量表达及分裂蛋白ftsZ,ftsA,ftsQ大
量表达，细菌仍能存活并分裂繁殖⑤
PBP3与细菌分裂相关。

在DNA复制完成后PBP3被激活，并催化梭基
肤酶反应，产生细菌分裂必需的肚聚糖合成反应。

低浓度的头抱菌素
作用于PBP3使细菌成为丝状体(细菌分裂受阻，菌体却持续延长)，但
一般菌体并不溶解⑥。

大肠杆菌PBP4同时具有D,D-梭肤酶活性及D.D一内肤酶活性⑦。

缺
乏PBP4的变异株能很好地存活，所以PBP4并不是β一内酞胺类抗生
素的主要作用靶位。

对PBP4一级结构的研究发现，编码PBP4主要活
性部位的基因SXXK,SXN及KIG与A型件内酞胺酶是同源的⑧。

在PBP4的SXXK与SXN之间有一区间，不同菌株PBP4氨基的顺序可在这区间
删除不等量氨基酸，与原PBP4蛋白比较，分子量可从1%至79%不等，
但对基本功能影响甚少⑨。

PBPS具梭基肤酶活性，缺乏PBPS的变异株对某些抗生素特别敏感，
而且PBP5功能受PBP2影响。

在缺乏PBP4与PEPS的变异株中，其功
能可由PBP3完成。

PBPS有膜型和游离型两种，其中游离型可在细胞内形成结晶⑩。

在PBP5梭基端有一约100个氨基酸的末端，切除此末端
仍保留PBP5蛋白与青霉素结合水平及酶活性，但容易被蛋白酶降解，
说明这个拨基末端具有稳定蛋白质的作用⑾。

PBP6不具梭基肤酶活性，但在细菌静止期有稳定肤聚糖结构的作用。

过量PBP6在胞浆内表达，可增加胞内胞膜小泡形成⑿。

肺炎球菌主要有6种PBP蛋白，分别为高分子的
PBPla.PBP16,PBP2x,PBP2a,PBP2b及低分子的PBP3。

在耐青霉素菌中，PBPs谱及PBP2b,PBP2x基因序列有较大差异。

但敏感株PBPs谱却十分类似⒀。

用血清学分离的菌株中，同一血清型PBPs谱亦有变异.很少
有PBPs谱完全相同的菌株。

用基因分析的方法研究肺炎球菌中P$P1a,26,2x发现去除PBP2x,26
基因，细菌不能存活，而缺乏PBPla的菌株能够获得，说明PBP2x,26
是细菌生长必需蛋白质。

PBPla对细菌生长及对苯哇西林敏感性影响均不大⒁。

PBP2x为肺炎球菌对头抱唾肪敏感株的主要作用靶位，而在耐药株中
则成为数个靶位中的一个⒂PBP2x具催化不同酷类及硫醇酷底物水解与转肤反应.其催化活性与链霉菌R61的D.D-肤酶相似⒃。

现已能应用基因工程合成PBP2x水溶性衍生物，且在时可得到结晶。

该结晶能阻断
头抱菌素衍生物的生色反应，说明此结晶具有酶活性⒄。

肺炎球菌对
青霉素耐药都因为出现高分子PBP2x基因，耐药菌与敏感菌比较，耐
药株基因变异大。

因基因变异起源于不同菌株间基因重组，就象PBP2b 一样，耐药株PBP2x基因转移了使敏感株转变为耐药株⒅⒆.
PBP3为D,D-梭肤酶，对细菌胞膜性质影响很大。

PBP3含量减少可使
细菌对高温、甘氨酸及一些D-氮基酸特别敏感，且可使细菌对头抱唾
肘产生耐药}⒇,PBP3的氨基酸序列与大肠杆菌PBPS,PBP6及枯草杆菌PEPS非常相似。

PBP3以C端定位于胞膜.缺乏PBP3的细菌成不规则形态，体积增大，分裂严重受阻。

在胞内多部位出现异常中隔，并产生
厚薄不一的胞壁。

3不同PBP与卜内酞胺类结合水平及卜内酸胺类的联用
各种抗生素与PBP3亲和力均不同，所以抗菌活性亦不同。

作用于不
同PBP的压内酞胺类在联用时可产生协同作用。

不同PBP与抗生素亲
和力用玩表示(表1-3)。

美西林、克拉维酸可特异地与PBP2结合，多种青霉素、头饱菌素与PBPla亲和力较高。

头饱拉定、头抱哇林与PBP1b亲和力高。

头饱氨节、氨曲南、furazolocillin与PBP6亲和力较高.很多抗生素与PBPlbs及PBP3结合力往往有较大差异，所以联用时往往可产生协同效应。

美西林因为其特异地作用于PBP2，与较多作用于PBPI.PBP3的抗生素可产生协同作用，已证实其与氮节西林、阿莫西林、狡节西林、替卡
西林、阿洛西林、美洛西林、呱拉西林、头抱唾吩、头泡哇林、头抱
氨节、头抱拉定‘、头饱孟多、头饱西丁均呈协同抗菌作用⑥。

克拉维酸亦是特异地与PBP2结合，其与件内酞胺类的协同作用是公
认的，但因为克拉维酸是A-内酞胺酶的抑制剂，所以协同作用可由此
特性而产生。

但有人发现克拉维酸与卜内酞胺类合用在一些不产酶菌
中亦有协同表现，这就与其特异性结合PBP2相关(表4)。

这方面研究资料并不太多，但如果我们能切实找到与PBP作用点相对
应的抗生素，那么这在联合用药上将是有效的。

4PBPs谱变异与耐药性产生
PBPs谱包括PBP种类及其百分含量.因为不同菌株的PBP谱有其特异性，现已成为细菌的一种分类方式。

PBPs为抗生素的作用靶位，按此
分类有助于对细菌耐药性的推测及估价。

人们理解到PBPs谱的变异与
细菌耐药性密切相关。

临床分离耐亚胺培南的不动杆菌，其PBPs与青霉素的结合水平下降，该菌株不产生卜内酥胺酶，其耐药性主要同PBPs蛋白变异所致，比较
肠球菌的PBPs发现，25株中13株具附加77kDaPBP(PBP6'''')，而其
它菌株均有52kDaPBP(PBP7)和46kDaPBP<PBPB),PBP6与青霉素敏感性
关系不大，但PBP7与细菌耐药性却密切相关。

对耐青霉素奈瑟球菌的
研究亦发现PBP2结构改变，且其与抗生素的结合水平下降。

PBP2基因谱中，耐药菌株与敏感菌株仅在一个175bp基因段差异较大。

肺炎链
球菌耐药株中PBPs基因转移至敏感株可使敏感株变为耐药株。

5耐药基因溯源
关于耐药基因来源问题分歧很多，有人认为可通过基因突变，还有人
认为是通过不同菌株间的基因转移。

现在又有人实验发现了一个有趣
的现象。

在诺卡菌产生头霉素基因中含3种基因片段：一为典型的编
码卜内酞胺酶基因;一为编码PBP基因;另一为编码穿透胞膜蛋白基因，诺卡菌的各内酞胺酶与临床分离细菌中A型(β-内酞胺酶十分相似，
此a-内酞胺酶对青霉素有活性，但对头霉素无作用，在诺卡菌中有8
种PBPs，无一与头霉素结合，另一胞膜蛋白与抗生素合成及分泌的控
制相关.其抗生素、卜内酞胺酶与PBPs产生均保持平衡，是其存活的
条件在该实验中，能够看到在一个产生抗生素的微生物中，存有制衡
现象.整个微生物界亦如生物圈一样存有生存的竞争及制衡现象，我们
应用抗生素也正是利用了微生物界的这种制衡关系。

但耐药基因是否
亦是由此而来，即产抗生素的菌对敏感菌高度抑制使其表现为“失衡”而敏感菌从产抗生素的菌株得到耐药基因再次出现制衡，这是一个有
趣而耐人寻味的问题.在控制耐药菌感染中，能否再次利用这种现象，
以提供有效的治疗手段是值得探索的。

参考文献
1BayerMH.JBacteriol，1990,172(1)：35
2DenBlaauwenT,AarsmanM.NannigaN.JBac-teriol，1990：172(1)：
63
3delPortilloFG.dePedroM.JBacteriol，1990：172(10)：5863
4GotohN.JAntimicrobChemother，1990x25(4)：513
5VinellaD.JBacterio1.1993;173(20)：s7oa
6HaroldCNeu.AmJMed，1983;29
7KoratB.MolMicrobiol，1991;5(3)：675
8RubLG.FEMSMicrobiolLett.1991;68(1)：27
9MottlH.JBacteriol，1992：174(10)：3261
10vanderLindenMP.FEMSMicrobiolLett，1992;78(2^-3)：117
11vanderLindenMP.BiochemJ.1993;289(pt2)：593
12vanderLindenMP.JBacteriol，1992x174(23)：7572
13HakenbeckR.JInfectDis，1991;16a(2)：307
14KellCM.FEMSMicrobiolLett，1993;106(2)：171 15JaminM.FEMSLeft，1993;331(1^-2)：101
16JaminM.BiochemJ，1993;292(pt3)：735
17Charlierp.)MolBiol.1993;232(3)：
100718SumitaY.fAntibiot,1990}43(3)：314
19CoffeyT.FemsMicrobiolLett，1993r110(3)：335 20SelakovitchCL.MolGenGenet，1993,239(1-2)：77青霉素结合蛋白。