绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析

3 结果与分析

3.1质粒提取

用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。

3.2

双酶切

用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。

3.3 抗性筛选

通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感

图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图

1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果

图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a

1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒

受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有

抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板

长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中

不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。

失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致

培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃

上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。

图3重组质粒转化DH5α感受态细胞

1号图为不含卡那的阴性对照

2号图为含卡那的阴性对照

3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照

4号图为含卡那的连接产物结果

3.4PCR鉴定

经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图

四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基

因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。

图4阳性重组菌的PCR鉴定

1、2号泳道为重组质粒转化结果

3.5重组质粒提取

用醋酸铵法提取pET-28a-GFP后，进行琼脂糖凝胶电泳检测，重组质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图五所示，1、2号泳道均有明显条带，说明重组质粒提取成功。

1、2号泳道为重组质粒转化结果

图 5 pET-28a-GFP质粒提取

3.6重组质粒酶切鉴定

用BamH1和Xho1对重组质粒进行双酶切验证。1、2号泳道重组质粒的酶切结果，如图六所示，电泳得到两条带，750bp左右的为GFP和5300bp左右的为PET-28a

说明质粒重组成功。

3.7绿色荧光蛋白表达与观察

1 2

3 4

图7重组质粒转化BL-21感受态细胞

一号板为平板中不含卡那的阴性对照二号板为含卡那的阴性对照

三号板为含卡那的阳性对照四号板为平板中含有卡那及IPTG的实验结果。

结果如上图所示，一号板生长较多菌落，说明BL-21感受态细胞存活。二号板也生长出菌落，有可能是因为发生突变。三号板中生长出较多菌落，证明卡那有效。在四号平板中，经过IPTG的诱导，大部分菌落成功发出荧光，说明GFP基因在大肠杆菌中成功表达。

参考文献

[1]J. Sambrook, E. P Fritsch, T. Maaniatis, MolecuLar cloning A laboratory Manual

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989

[2]L戴维斯等编著，姚志建等译，《分子生物学实验技术》,34-36，科学出版

社,1990

[3]贺竹梅，刘秋云，一种提取质粒DNA的改良方法，生物技术6(1),37

38,1996

[4]王重庆等编著，《高级生物化学实验教程》，北京大学出版社,95

107,1994

[5]郝福英，朱玉贤等编《基础分子生物学实验》，北京大学出版社,2010

致谢

感谢老师的专业指导，感谢同组同学的帮助。