近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展

收稿日期:2007207211

基金项目:国家自然科学基金(No.20575047,39970206,29575206,20775058)

3通讯联系人:张华山,男,教授,博士生导师,研究方向:分子探针与检测试剂,现代分离.

第24卷第2期

Vol.24　No.2分析科学学报J OU RNAL OF ANAL YTICAL SCIENCE 2008年4月Apr.2008文章编号:100626144(2008)022*******

近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展

傅妮娜1,2,王　红1,张华山31

(1.武汉大学化学与分子科学学院,武汉430072;

2.南京邮电大学公共基础课学部,南京210003)

摘　要:本文评述了自1999年以来近红外荧光探针和标记试剂及其在生物分析中的应

用进展。包括:菁染料、噻嗪和噁嗪染料、含四吡咯基团染料(酞菁和卟啉)、罗丹明类、

BODIP Y 、稀土离子配合物和量子点等。描述了它们在荧光测定和毛细管分离荧光检

测以及免疫荧光分析方面的应用。引用文献75篇。

关键词:近红外荧光探针;荧光检测;生物分析

中图分类号:O657.33 文献标识码:A

1　前言

荧光光谱法由于其灵敏度高、选择性好,获得的信息直观、准确,能科学表达解释复杂样品的结构、分布、含量及生理功能等诸多问题,所以在生物分析及造影方面应用广泛。荧光染料或荧光试剂作为分子探针在生命科学领域备受瞩目。许多生物体及其组织在可见光的激发下自身会发射荧光,严重干扰生物样品的荧光检测和造影,如血浆中血清蛋白的荧光波长范围为325～350nm ,还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸酶(NADP H )和胆红素的荧光波长范围为430～470nm ,故使得可见光区荧光分析的灵敏度和准确性受到了很大的影响。近红外荧光探针的最大吸收波长和发射波长为600～900nm ,可避免背景干扰。所以,近红外荧光检测在生物样品分析中有明显的优越性。

二极管激光器的问世,打破了由于传统的激发光源无法在近红外区激发而使近红外荧光染料的应用长期以来一直受到的限制。以此为基础发展起来的新的、近红外荧光试剂及检测技术广泛地应用于核酸、蛋白质、生物造影、免疫分析等领域,在生物分析中显示出巨大的潜力。当然,近红外荧光染料也存在着不足之处,如染料种类不多,合成困难,染料的光、热、化学性质不稳定等。对此文献[1]曾作过评述。本文主要对1999年以来近红外荧光探针及其应用进展进行评述。

2　菁染料(Cyanine)

近红外区的菁染料一般都是指五甲川和七甲川菁染料。另一方面,菁染料光稳定性较差,易发生光氧化漂白。菁染料的光氧化具有以下特点:(1)在溶液中的光氧化反应符合一级反应动力学过程;(2)菁染料中甲川链结构相同时,杂环母核上取代杂原子增大,稳定性降低,即吲哚>噁唑>噻唑>硒唑;(3)当杂环母核结构相同时,甲川链越长,光稳定性越差。这些对于设计光稳定较好的近红外菁染料具有非常重要的指导意义。

菁染料标记生物样品主要有静电/疏水作用非共价、共价形式以及通过活性基团与一些生物分子形成生物结合物(Bioconjugate ),用于标记核酸、蛋白质、免疫分析和造影等。

用于DNA 分析的近红外菁染料中最重要的就是噻唑橙及噁唑橙二聚体和单聚体。二聚体叫TO TO 3

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第2期傅妮娜等:近红外荧光探针及其在生物分析中的应用进展第24卷

系列染料,也叫菁染料对称二聚体[1],包括:POPO23、BOBO23、YO YO23、TO TO23染料等。单聚体染料包括:PO2PRO23、BO2PRO23、YO2PRO23、TO2PRO23和TO2PRO25五种。这类荧光探针本身荧光较弱,标记DNA后荧光显著增强。Flanagan等[2]合成含卤素(X=F、Cl、Br、I)的七甲川菁染料(Ⅰ),具有不同的荧光寿命,可用于DNA序列分析。而3,3′2二乙基苯并噻唑碳菁染料(DiSC2(5),Ⅱ)最大吸收波长为647 nm,在含有重复A2T碱基对的双螺旋DNA存在下,光谱分析表明,最大吸收波长从647nm移至590 nm[3]。噻绿(TA G)[4]也是一个测定低浓度DNA的有效荧光探针,它和DNA结合后,荧光增强100倍。

用近红外菁染料非共价标记蛋白直接测定的文献较少,因为大多数菁染料标记蛋白前后的光谱变化不大。用七甲川花菁吸收光度法直接测定蛋白方法已有报道[5,6],若采用荧光检测方法可能会得到更高的灵敏度。在蛋白聚谷氨酸酯共存在下测定蛋白的荧光光度法,对BSA、HSA、和γ2Ig G的检出限分别为37、40、43ng・mL-1,并应用于血清样品,结果令人满意[7]。一些对溶剂敏感的部花菁也与蛋白共价结合,用于研究活细胞中蛋白构型的变化[8]。采用毛细管电泳作为分离手段检测蛋白质也有报道,如Colyer等研究方酸菁NN127(Ⅲ)、NN525(Ⅳ)和SQ23(Ⅴ)与蛋白非共价结合的荧光和电泳行为[9]。HITCI(Ⅵ)非共价结合牛血清白蛋白BSA,用CE2L IF检测详细研究其荧光性质和标记行为[10]发现HITCI与BSA 结合荧光增强。Jing等[11-13]用商品化的Cy5共价标记了模型蛋白BSA,采用CE2L IF检测,研究了菁染料与BSA的结合常数、复合物峰扩宽等。近红外的菁染料在蛋白质组学上的应用也初露头角,虽然目前还仅限于标记巯基和氨基的系列Cy5近红外菁染料[14-16],将会有更优良的近红外菁染料用于蛋白质组学研究。

菁染料可通过活性反应基团与抗体或抗原蛋白质结合,形成染料2蛋白质结合物,从而进行检测。Williams和Peralta[17]把七甲川花菁染料用于固相免疫测定方面,可测定痕量人体免疫球蛋白。用荧光探针标记的GA H G(G oat Anti2HumanImmunoglobulins)和人免疫球蛋白发生免疫反应,基于夹心(Sand2 wich)检验法,来自双氧水的过氧化物产生的羟基对荧光有猝灭作用,可用来检测酶的活性[17]。

毛细管电泳免疫分析(Capillary Elect rop horesis Based Immunoassay,CEIA)是利用抗原抗体复合物与游离的抗原、抗体在电泳行为上的差异,用毛细管电泳进行分离检测的一种分析方法。利用Cy5标记

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