紫外圆二色光谱预测蛋白质结构的研究方法

紫外圆二色光谱预测蛋白质结构的研究方法

黄汉昌　姜招峰3　朱宏吉#

(北京联合大学应用文理学院生物活性物质与功能食品北京市重点实验室　北京　100083;

#天津大学化工学院　天津　300072)

摘　要　介绍了蛋白质紫外圆二色性(C D)产生的原理及其与蛋白质结构的关系。评述了用远紫外C D 预测蛋白质二级结构的方法原理、参考蛋白、拟合算法和拟合程序,以及方法存在的问题。近紫外C D与蛋白

质的三级结构密切相关,近紫外蛋白质C D反映芳香氨基酸残基、二硫键等微环境的变化,表征着丰富的蛋白

质三级结构的信息。

关键词　圆二色　蛋白质结构　紫外光谱

The Methods of Protein Conformation Predicted by UV2Circular Dichroism

Huang Hanchang,Jiang Zhaofeng3,Zhu H ongji#

(Beijing Union University Beijing K ey Laboratory of Bioactive Substances and Functional F oods,Beijing100083;

#School of chemical engineering and technology,T ianjin University,T ianjin300072)

Abstract　The principle of protein circular dichroism(C D)and the relationship between protein structures and its C D are introduced in this article.The methods,including principle,reference proteins,fitting alg orithm and its program,of

protein secondary structures predicted by far ultraviolet(UV)C D are reviewed.The proteins near UV C D spectra contain

the in formation of the aromatic amino acids and disulfide group which are hypersensitive to environmental changes,and they

im ply the protein tertiary structures in formation.

K ey w ords　Circular dichroism,Protein secondary structure,Ultraviolet spectra

自上世纪80年代以来,结构生物化学得到了迅速的发展,生物大分子结构的测定逐渐成为生命科学研究领域的热门课题。人类基因组测序完成后,蛋白质组学的相关研究成为生物学中的重要课题。蛋白质是生物活性大分子物质,蛋白质的结构对生物活性有着重要的影响,其结构的变化将会导致其它性能的变化。目前,确定蛋白质结构的最准确方法是X射线晶体衍射,它要求蛋白质是晶体存在状态,不过,对结构复杂、柔性的生物大分子蛋白质来说,要得到所需的晶体结构较为困难。二维、多维核磁共振技术能测出溶液状态下较小蛋白质的结构,可是对分子量较大的蛋白质的数据计算处理非常复杂。相比之下,圆二色(Circular Dichroism,简称C D)是研究稀溶液中蛋白质结构的一种快速、简单、较准确的方法。自1969年G reenfield用圆二色光谱数据估计了蛋白质二级结构后[1],有关C D光谱研究蛋白质结构的报道增多[2～10]。圆二色现象是由光学活性物质对左右圆偏振光的吸光率之差引起的,按照圆二色产生的机理,圆二色有几种类型:由电子跃迁引起的,一般称之为圆二色(C D),又称为EC D;由分子振动引起的,称为VC D;另外还有荧光C D,拉曼旋光等。本文只对由电子跃迁引起的圆二色现象,就用紫外C D光谱技术分析蛋白质二级和三级结构的基本原理及其研究方法进展作一评述。

1　蛋白质的圆二色性原理

当一束平面偏振光通过具有手性的介质时,由于该介质对左右旋圆偏振光的折射率不同,使得它们通过介质的速率也不同,因此叠加产生的平面偏振光的偏振方向将会改变,产生旋光性;同时,由于手性

北京市教委和北京市自然基金资助项目(K Z200311417015)

2006212204收稿,2007201229接受

介质对左右旋圆偏振光的摩尔吸光率(εl (λ),εd (λ))不同,产生一个差值Δε(λ)=εl (λ)-εd (λ

),使得左右旋圆偏振光通过介质后的振幅也将不同,这样两者叠加而形成椭圆偏振光。圆二色也常用摩尔椭

圆率[θ(λ)](单位为deg ・cm 2・dm ol -1)来表示,[θ(λ

)]与Δε(λ)存在以下换算关系[11],[θ]=4500π・log e 10Δε(1)

一般手性物质的圆二色性与波长有关,如果对手性物质按照一定的波长扫描,便得到其C D 光谱图,从图谱上可以了解其分子及结构上的手性特性。

蛋白质或多肽是由氨基酸通过肽键连接而成的、具有特定结构的生物大分子,主要的光学活性生色基团是肽链骨架中的肽键、芳香氨基酸残基及二硫桥键,另外,有的蛋白质辅基对蛋白质的圆二色性也有影响。蛋白质一般有一级结构、二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构几个结构层次,相同的氨基酸序列,因蛋白质的折叠结构不同,影响了其光学活性生色基团的光学活性,其圆二色性也有较大的差异。蛋白质的圆二色性主要由活性生色基团及折叠结构两方面圆二色性的总和。根据电子

跃迁能级能量的大小,蛋白质的C D 光谱分为三个波长范围[12]:(1)250nm 以下的远紫外光谱区,圆二色

性主要由肽键的n →

π3电子跃迁引起[13];(2)250～300nm 的近紫外光谱区,主要由侧链芳香基团的π→π3电子跃迁引起;(3)300～700nm 的紫外2可见光光谱区,主要由蛋白质辅基等外在生色基团引起。蛋白质的C D 光谱已经应用于预测蛋白质的折叠结构等。相应于蛋白质C D 产生的机理,远紫外C D 主要应用于蛋白质二级结构的解析,近紫外C D 主要揭示蛋白质的三级结构信息,紫外2可见光C D 主要用于辅基的偶合分析。

2　远紫外CD 预测蛋白质二级结构的方法

利用圆二色光谱仪获得蛋白质C D 主要的工作包括:溶剂体系的选择,蛋白质溶液样品的制备

[14],圆二色光谱仪实验参数的选择与调整等。对此,K elly 等[15]已经作了较为全面的综述。正确的蛋白质

C D 图谱是预测蛋白质结构的基础与关键。在正确获得蛋白质C D 后,主要的工作是如何从C D 图谱解析蛋白质的结构信息。远紫外C D 预测蛋白质二级结构的方法,主要是运用计算机采用一定的拟合算法对C D 数据进行加工处理,进而解析蛋白质二级结构

。

图1　α2螺旋、β2折叠、β2转角及P2构象的多肽的CD 谱[16]

Fig .1　Circular dichroism (CD)

spectra of polypeptides in the α2helical ,β2sheet ,β2turn and P2conform ation [16](○)α2螺旋;(●)β2折叠;(Δ)β2转角;(∀)P2(011m ol ΠL 醋酸溶液中的聚2L 2脯氨酸)

211　预测方法的基本原理

远紫外区C D 光谱主要反映肽键的圆二色性。在蛋白质或多肽的规则二级结构中,肽键是高度有规律排列的,其排列的方向性决定了肽键能级跃迁的分裂情况。具有不同二级结构的蛋白质或多肽所产生C D 谱带的位置、吸收的强弱都不相同。因此,根据所测得

蛋白质或多肽的远紫外C D 谱,能反映出蛋白质或多肽链二级

结构的信息,从而揭示蛋白质或多肽的二级结构。如图1所

示[16],α2螺旋结构在靠近192nm 有一正的谱带,在222和208nm

处表现出两个负的特征肩峰谱带;β2折叠的C D 光谱在216nm

有一负谱带,在185～200nm 有一正谱带;β2转角则在206nm 附

近有一正C D 谱带;而左手螺旋P2构象在相应的位置有负的C D

谱带。

单一波长常用于测定蛋白质或多肽由动力学或热力学引起

的二级结构的变化。α2螺旋结构在208及222nm 有特征吸收

峰,可以利用这两处的摩尔椭圆度[θ]208或[θ]222来简单估计α2

螺旋的含量[17]。这种方法的优点是能够快速地获取这两点的实验数据,反映瞬时的动力学和热力学信息,可作为光谱探针对

α2螺旋的变化作简单的推算;但缺点是忽略了蛋白质中其它二

级结构及芳香基团对[θ]的贡献,分析结果具有偏差。对于非

α2螺旋结构含量的估算,由于α2螺旋的C D 值对其它螺旋结构