典型水稻土中固碳基因及功能微生物研究
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关键词：水稻土，微生物固碳，marker 基因，环境因子，根际效应
III
ABSTRACT
ABSTRACT
Terrestrial ecosystem is the second largest carbon (C) pool on the earth. Agricultural land is an important part of terrestrial ecosystem, and therein C pool is the most active part under frequent human disturbance (tillage, fertilization, drainage, and irrigation), especially for paddy soils. Microorganisms play an important role in the C turnover, as they are involved in almost all processes of the carbon cycle due to their high abundance and diverse metabolic pathways. The turnover of C during soil biomass formation and decomposition mediated by microorganisms leads to the release or sequestration of greenhouse gas CO2, affecting global warming potentially. Therefore, research on this process is of great significance for mitigating global warming, and also for scientific fertilization in agriculture and establishing low-carbon agriculture.
衷心感谢贺纪正老师、黄益宗老师、乔敏老师、胡莹老师、刘云霞老师、 孙国新老师、段桂兰老师、陈正老师、张丽梅老师、郑袁明老师和刘玉荣老师 的帮助与指导！衷心感谢中科院城市环境研究所的苏建强老师、亚热带所魏文 学老师和葛体达老师在样品采集、实验过程和数据分析方面的悉心指导。衷心 感谢生态中心人教处的杜向荣老师、任慧敏老师、冯娟老师和曹青老师在入学 和毕业过程中所给予的无私帮助。
至今已发现的微生物固定 CO2 途径有 5 条，即 Calvin 循环、还原性三羧酸 循环（rTCA）、还原性乙酰辅酶 A 途径、3-羟基丙酸盐/苹果酰-辅酶 A 循环和 4-羟基丁酸盐循环，其中 Calvin 循环途径是公认的主要的微生物固碳途径。在 这些生化途径中，催化关键反应步骤的酶常被认为是关键酶，其对应的编码基 因常用作 marker 基因，在微生物生态学研究中广泛应用于功能微生物的定量和 系统进化分析。然而，综合文献我们发现，目前的研究多集中于水生生态系统 和旱地，对于水稻土中的微生物固碳过程关注较少，而且对于除 Calvin 循环以 外的其他固碳途径研究也比较缺乏。
By Ke-Qing Xiao
A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences
In partial fulfillment of the requirement For the degree of
Master of Natural Science
衷心感谢众多朋友的关心，在你们的帮助和陪伴下我度过了三年快乐而充 实的时光。最后要感谢我的家人在我求学过程中给予的无私奉献和始终如一的 鼓励！是你们叮嘱和支持让我不敢懈怠，能够始终积极面对人生。
最后感谢国家自然科学基金项目（No. 41090280，No. 41090282）对我硕士 论文工作的支持！
硕士学位论文
典型水稻土中固碳基因及功能微生物研究
作者姓名： 指导教师:
学位类别: 学科专业: 培养单位:
肖可青 朱永官 研究员 中国科学院生态环境研究中心
理学硕士 环境科学 中国科学院生态环境研究中心
2014 年 5 月
Байду номын сангаас
Genetic characterization of microbial CO2 fixation in typical paddy soil
肖可青 2014 年 5 月
I
摘要
摘要
陆地生态系统是地球上仅次于海洋生态系统的第二大碳（C）库。农田土 壤是陆地生态系统的重要组成部分，由于人类活动的长期干扰（如耕作、施肥、 排水和灌溉等）使得该 C 库成为最活跃的一部分，而这一特征在水稻土中尤为 明显。微生物在 C 元素循环过程中扮演中极为重要的作用，它们有极高的丰度 和代谢多样性，几乎参与了 C 循环的所有环节。由微生物调控的土壤 C 循环过 程可以固定或释放温室效应气体 CO2，进而影响全球气候。研究微生物固定 CO2 的分子生态机理对于缓解全球气候变暖具有重要科学意义，同时也可以为农田 土壤肥力科学化管理提供技术支撑，为正确评估农田土壤固碳潜力及低碳农业 规划提供科学依据。
2. 微宇宙实验 选取其中两种不同类型的水稻土进行室内模拟实验，采用根袋区分和收集根 际与非根际土壤，进行氮肥处理，并在不同的水稻生长期采样，重点考察根际效 应对微生物固碳过程的影响。利用qPCR揭示了3种自养固碳途径的marker基因在 水稻不同生长阶段在根际与非根际土壤中的变化与多样性。基于偏冗余分析 （pRDA）的变量分离研究显示生长期、土壤类型和根际效应与基因丰度变异均 显著相关（P < 0.05），分别贡献了37%，19%和12%的解释量，而氮处理（尿素 添加）则没有显著贡献（P ＞0.05）。结果表明不同环境因素对土壤固炭基因丰 度变异影响顺序为：生长周期 ＞ 土壤类型 ＞ 根际效应。可以说，水稻土中固 定CO2的自养微生物受多种环境因素及其相互作用共同影响。 以上研究表明，水稻土具有很大的微生物固碳潜力。Calvin 循环的 3 个 marker 基因中，cbbLR 基因由于其高丰度可能比另外两个基因发挥更重要的作 用，而环境因子如 CEC、pH、粘粒含量、C/N 和 SOC 等对基因多样性有显著 影响。自养固碳途径的 marker 基因在水稻不同生长阶段在根际与非根际土壤中 的变化与多样性。而生长周期和土壤类型对这些基因丰度的变异影响更大，而 根际效应贡献相对较少。因此水稻土微生物固碳受多种环境因素及其相互作用 共同影响。本研究部分揭示了水稻土中微生物固碳分子生态机理，对于理解微 生物在全球气 C 循环过程中的作用具有一定科学意义，也可以为农田土壤肥力 科学化管理和构建低碳农业提供科学依据。
II
典型水稻土中微生物固碳研究
高于 cbbM 和 cbbLG，且其丰度与土壤固碳酶活性显著正相关，我们推测 cbbLR 在 3 种基因中可能发挥着更大的作用。与土壤理化性质进行统计分析显示粘粒 含量、碳氮比、阳离子交换量（CEC）、pH 和土壤有机碳（SOC）含量对微生 物群落组成和 marker 基因丰度变异显著相关。
Over the past 60 years, five CO2 fixation pathways have been found successively: the Calvin cycle, the reductive tricarboxylic acid (rTCA) cycle, the reductive acetyl-CoA pathway, the 3-hydroxypropionate/malyl-CoA cycle and the 4hydroxybutyrate cycle. Among them, the Calvin cycle is known to be the major pathway for microbial CO2 fixation. The enzymes catalyzing mechanistically difficult steps in a given pathway are usually conserved and act as key enzymes; the corresponding coding genes, often named as marker genes, are ubiquitously used in microbial ecological studies. However, to data, previous studies have emphasized either upland soils or aquatic environment, and also paid little attention to other pathways apart from the Calvin cycle.
基于此，本研究利用酶活测定、实时定量 PCR（qPCR）、末端限制性长度 多态性分析（T-RFLP）、克隆和测序等多种生物学技术，收集我国南方五种典 型水稻土，对其中通过 Calvin 循环进行自养固碳的微生物进行了原位研究；其 次选取其中两种不同类型的水稻土进行室内模拟实验，采用根袋区分和收集根 际与非根际土壤，进行氮肥处理，并在不同的水稻生长期采样，重点考察根际 效应对微生物固碳过程的影响。结合土壤理化性质测定和统计分析，探究影响 微生物固碳过程的关键环境因子及其贡献。论文主要的研究内容与成果如下：
1. 原位土壤研究 对我国南方五种典型水稻土中通过 Calvin 循环进行自养固碳的微生物进行 原位研究。利用酶活性测定、qPCR、克隆文库以及 T-RFLP 方法结合土壤理化 性质分析研究发现：Calvin 循环途径的 3 种 marker 基因中，cbbLG 多样性最低， 且序列多和硫杆菌属的一些细菌相似度较高；与此对应，cbbLR 和 cbbM 基因 具有很高的多样性，其序列大多独立成簇，不能归类到已知的细菌类群中。qPCR 结果显示 3 种基因丰度范围在在 106-109 拷贝数/克干土，并且 cbbLR 的丰度均
Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences
May, 2014
独创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人
承担。
学位论文作者签名：___________________ 日 期：_________________
关于论文使用授权的说明
本人完全了解中国科学院生态环境研究中心有关保留、使用学位论文的规 定，即：中国科学院生态环境研究中心有权保留送交论文及复印件，允许论文 被查阅和借阅；可以公布论文的全部或部分内容，可以采用复制或其他手段保 存论文。
特别感谢尹西翔师兄、鲍鹏师兄、贾炎师兄、王凤花师姐、保琼莉师姐、 王培培师姐、丁龙君师姐和张思宇师姐的无私帮助，使我在实验的各个过程中 能够快速入门；衷心感谢聂三安师兄、李虎师兄和黄福义等对我实验的大力帮 助；衷心感谢黄海、王光鹏、刘欣、梁建宏、张轩、伍文、降光宇、孙晓铧、 张偲、徐峰、王斐、解惠婷、孙芬芬、王珊、周雪、王亚洁、李季、向猛、刘 心等兄弟姐妹在实验上的帮助和生活上的照顾。你们乐观开朗的生活态度和孜 孜不倦的求学精神一直感染着我，三年的美好时光我将终生难忘。
（保密的论文在解密后应遵守此规定）
签名：
导师签名：
日期：
致谢
致谢
光阴如梭，三年科院求学之旅，转眼即将逝去。三年前，在获得了研究生 免试推荐资格后，怀着对科学研究的热爱，我毅然选择了中科院这片科研热土， 不仅因为她大师辈出的历史与现实，更向往这里务实进取的良好氛围。
科院的培养制度一方面使我们能在第一年全身心进行课程学习扎实掌握理 论知识，另一方面相比从第一年就可以进入实验室做实验的高校同学，我们却 少了近一年的时间，无形中增加了论文和毕业的压力。如今能顺利申请毕业答 辩，我要首先感谢我的导师朱永官研究员。本论文是在导师朱永官研究员的悉 心指导下完成的，从论文选题、试验设计、结果分析到论文写作的各个环节都 倾注了恩师的心血与教导。恩师渊博的知识，严谨的治学态度，忘我的工作精 神，活跃的学术思维，雷厉风行的做事风格，高尚的人格和宽广的胸怀，使我 受益匪浅。值此论文完成之际，在此谨向恩师表达最诚挚的感谢与祝福！
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ABSTRACT
ABSTRACT
Terrestrial ecosystem is the second largest carbon (C) pool on the earth. Agricultural land is an important part of terrestrial ecosystem, and therein C pool is the most active part under frequent human disturbance (tillage, fertilization, drainage, and irrigation), especially for paddy soils. Microorganisms play an important role in the C turnover, as they are involved in almost all processes of the carbon cycle due to their high abundance and diverse metabolic pathways. The turnover of C during soil biomass formation and decomposition mediated by microorganisms leads to the release or sequestration of greenhouse gas CO2, affecting global warming potentially. Therefore, research on this process is of great significance for mitigating global warming, and also for scientific fertilization in agriculture and establishing low-carbon agriculture.
衷心感谢贺纪正老师、黄益宗老师、乔敏老师、胡莹老师、刘云霞老师、 孙国新老师、段桂兰老师、陈正老师、张丽梅老师、郑袁明老师和刘玉荣老师 的帮助与指导！衷心感谢中科院城市环境研究所的苏建强老师、亚热带所魏文 学老师和葛体达老师在样品采集、实验过程和数据分析方面的悉心指导。衷心 感谢生态中心人教处的杜向荣老师、任慧敏老师、冯娟老师和曹青老师在入学 和毕业过程中所给予的无私帮助。
至今已发现的微生物固定 CO2 途径有 5 条，即 Calvin 循环、还原性三羧酸 循环（rTCA）、还原性乙酰辅酶 A 途径、3-羟基丙酸盐/苹果酰-辅酶 A 循环和 4-羟基丁酸盐循环，其中 Calvin 循环途径是公认的主要的微生物固碳途径。在 这些生化途径中，催化关键反应步骤的酶常被认为是关键酶，其对应的编码基 因常用作 marker 基因，在微生物生态学研究中广泛应用于功能微生物的定量和 系统进化分析。然而，综合文献我们发现，目前的研究多集中于水生生态系统 和旱地，对于水稻土中的微生物固碳过程关注较少，而且对于除 Calvin 循环以 外的其他固碳途径研究也比较缺乏。
By Ke-Qing Xiao
A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences
In partial fulfillment of the requirement For the degree of
Master of Natural Science
衷心感谢众多朋友的关心，在你们的帮助和陪伴下我度过了三年快乐而充 实的时光。最后要感谢我的家人在我求学过程中给予的无私奉献和始终如一的 鼓励！是你们叮嘱和支持让我不敢懈怠，能够始终积极面对人生。
最后感谢国家自然科学基金项目（No. 41090280，No. 41090282）对我硕士 论文工作的支持！
硕士学位论文
典型水稻土中固碳基因及功能微生物研究
作者姓名： 指导教师:
学位类别: 学科专业: 培养单位:
肖可青 朱永官 研究员 中国科学院生态环境研究中心
理学硕士 环境科学 中国科学院生态环境研究中心
2014 年 5 月
Байду номын сангаас
Genetic characterization of microbial CO2 fixation in typical paddy soil
肖可青 2014 年 5 月
I
摘要
摘要
陆地生态系统是地球上仅次于海洋生态系统的第二大碳（C）库。农田土 壤是陆地生态系统的重要组成部分，由于人类活动的长期干扰（如耕作、施肥、 排水和灌溉等）使得该 C 库成为最活跃的一部分，而这一特征在水稻土中尤为 明显。微生物在 C 元素循环过程中扮演中极为重要的作用，它们有极高的丰度 和代谢多样性，几乎参与了 C 循环的所有环节。由微生物调控的土壤 C 循环过 程可以固定或释放温室效应气体 CO2，进而影响全球气候。研究微生物固定 CO2 的分子生态机理对于缓解全球气候变暖具有重要科学意义，同时也可以为农田 土壤肥力科学化管理提供技术支撑，为正确评估农田土壤固碳潜力及低碳农业 规划提供科学依据。
2. 微宇宙实验 选取其中两种不同类型的水稻土进行室内模拟实验，采用根袋区分和收集根 际与非根际土壤，进行氮肥处理，并在不同的水稻生长期采样，重点考察根际效 应对微生物固碳过程的影响。利用qPCR揭示了3种自养固碳途径的marker基因在 水稻不同生长阶段在根际与非根际土壤中的变化与多样性。基于偏冗余分析 （pRDA）的变量分离研究显示生长期、土壤类型和根际效应与基因丰度变异均 显著相关（P < 0.05），分别贡献了37%，19%和12%的解释量，而氮处理（尿素 添加）则没有显著贡献（P ＞0.05）。结果表明不同环境因素对土壤固炭基因丰 度变异影响顺序为：生长周期 ＞ 土壤类型 ＞ 根际效应。可以说，水稻土中固 定CO2的自养微生物受多种环境因素及其相互作用共同影响。 以上研究表明，水稻土具有很大的微生物固碳潜力。Calvin 循环的 3 个 marker 基因中，cbbLR 基因由于其高丰度可能比另外两个基因发挥更重要的作 用，而环境因子如 CEC、pH、粘粒含量、C/N 和 SOC 等对基因多样性有显著 影响。自养固碳途径的 marker 基因在水稻不同生长阶段在根际与非根际土壤中 的变化与多样性。而生长周期和土壤类型对这些基因丰度的变异影响更大，而 根际效应贡献相对较少。因此水稻土微生物固碳受多种环境因素及其相互作用 共同影响。本研究部分揭示了水稻土中微生物固碳分子生态机理，对于理解微 生物在全球气 C 循环过程中的作用具有一定科学意义，也可以为农田土壤肥力 科学化管理和构建低碳农业提供科学依据。
II
典型水稻土中微生物固碳研究
高于 cbbM 和 cbbLG，且其丰度与土壤固碳酶活性显著正相关，我们推测 cbbLR 在 3 种基因中可能发挥着更大的作用。与土壤理化性质进行统计分析显示粘粒 含量、碳氮比、阳离子交换量（CEC）、pH 和土壤有机碳（SOC）含量对微生 物群落组成和 marker 基因丰度变异显著相关。
Over the past 60 years, five CO2 fixation pathways have been found successively: the Calvin cycle, the reductive tricarboxylic acid (rTCA) cycle, the reductive acetyl-CoA pathway, the 3-hydroxypropionate/malyl-CoA cycle and the 4hydroxybutyrate cycle. Among them, the Calvin cycle is known to be the major pathway for microbial CO2 fixation. The enzymes catalyzing mechanistically difficult steps in a given pathway are usually conserved and act as key enzymes; the corresponding coding genes, often named as marker genes, are ubiquitously used in microbial ecological studies. However, to data, previous studies have emphasized either upland soils or aquatic environment, and also paid little attention to other pathways apart from the Calvin cycle.
基于此，本研究利用酶活测定、实时定量 PCR（qPCR）、末端限制性长度 多态性分析（T-RFLP）、克隆和测序等多种生物学技术，收集我国南方五种典 型水稻土，对其中通过 Calvin 循环进行自养固碳的微生物进行了原位研究；其 次选取其中两种不同类型的水稻土进行室内模拟实验，采用根袋区分和收集根 际与非根际土壤，进行氮肥处理，并在不同的水稻生长期采样，重点考察根际 效应对微生物固碳过程的影响。结合土壤理化性质测定和统计分析，探究影响 微生物固碳过程的关键环境因子及其贡献。论文主要的研究内容与成果如下：
1. 原位土壤研究 对我国南方五种典型水稻土中通过 Calvin 循环进行自养固碳的微生物进行 原位研究。利用酶活性测定、qPCR、克隆文库以及 T-RFLP 方法结合土壤理化 性质分析研究发现：Calvin 循环途径的 3 种 marker 基因中，cbbLG 多样性最低， 且序列多和硫杆菌属的一些细菌相似度较高；与此对应，cbbLR 和 cbbM 基因 具有很高的多样性，其序列大多独立成簇，不能归类到已知的细菌类群中。qPCR 结果显示 3 种基因丰度范围在在 106-109 拷贝数/克干土，并且 cbbLR 的丰度均
Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences
May, 2014
独创性声明
本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研 究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个 人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人
承担。
学位论文作者签名：___________________ 日 期：_________________
关于论文使用授权的说明
本人完全了解中国科学院生态环境研究中心有关保留、使用学位论文的规 定，即：中国科学院生态环境研究中心有权保留送交论文及复印件，允许论文 被查阅和借阅；可以公布论文的全部或部分内容，可以采用复制或其他手段保 存论文。
特别感谢尹西翔师兄、鲍鹏师兄、贾炎师兄、王凤花师姐、保琼莉师姐、 王培培师姐、丁龙君师姐和张思宇师姐的无私帮助，使我在实验的各个过程中 能够快速入门；衷心感谢聂三安师兄、李虎师兄和黄福义等对我实验的大力帮 助；衷心感谢黄海、王光鹏、刘欣、梁建宏、张轩、伍文、降光宇、孙晓铧、 张偲、徐峰、王斐、解惠婷、孙芬芬、王珊、周雪、王亚洁、李季、向猛、刘 心等兄弟姐妹在实验上的帮助和生活上的照顾。你们乐观开朗的生活态度和孜 孜不倦的求学精神一直感染着我，三年的美好时光我将终生难忘。
（保密的论文在解密后应遵守此规定）
签名：
导师签名：
日期：
致谢
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光阴如梭，三年科院求学之旅，转眼即将逝去。三年前，在获得了研究生 免试推荐资格后，怀着对科学研究的热爱，我毅然选择了中科院这片科研热土， 不仅因为她大师辈出的历史与现实，更向往这里务实进取的良好氛围。
科院的培养制度一方面使我们能在第一年全身心进行课程学习扎实掌握理 论知识，另一方面相比从第一年就可以进入实验室做实验的高校同学，我们却 少了近一年的时间，无形中增加了论文和毕业的压力。如今能顺利申请毕业答 辩，我要首先感谢我的导师朱永官研究员。本论文是在导师朱永官研究员的悉 心指导下完成的，从论文选题、试验设计、结果分析到论文写作的各个环节都 倾注了恩师的心血与教导。恩师渊博的知识，严谨的治学态度，忘我的工作精 神，活跃的学术思维，雷厉风行的做事风格，高尚的人格和宽广的胸怀，使我 受益匪浅。值此论文完成之际，在此谨向恩师表达最诚挚的感谢与祝福！