微生物果胶酶研究进展

微生物果胶酶研究进展

果胶质广泛存在于高等植物中，是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分，植物的细胞组织间起“黏合”作用。近几年来，果胶质的生物降解日益引起国内外学者的广泛关注。能够分解果胶质的酶被称作果胶酶(pectinase)，它广泛存在于各种微生物中，细菌、真菌和放线菌都能产生相关酶类。果胶酶类的应用领域非常广泛，不仅可用于食品工业如水果加工及葡萄酒生产等方面，还广泛应用于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料等行业中。果胶酶主要分为原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶和果胶酯酶等几大类，研究果胶酶各组分的性质，有利于果胶酶的单一酶种的开发利用。同时微生物果胶酶的分子生物学研究将有助于更合理地利用果胶酶。

1、果胶简介

果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起[1]。它存在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白(extensin)[2]相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态．果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，其大致的结构简图如图1所示，总体可分为光滑区(smooth region)和须状区(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在．同其它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布。

2、果胶酶分类

从广义上讲，果胶酶可以被分为3种类型：①原果胶酶：可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的高聚合体果胶；②果胶酯酶：脱去果胶中的甲氧基基团，促使果胶的脱甲酯作用；③解聚酶：促使果胶中D-半乳糖醛酸的α-1，4糖苷键的裂解。近来人们提出了更详细分类方法为[3]：原果胶酶(protopectinases)、多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)、裂解酶(pectin lyases, PL)、果胶酯酶(Pectinesterase, PE)。

2.1原果胶酶

Briton等人[4]把能够促使原果胶溶解的酶命名为原果胶酶。根据其作用机理分为两种类型：A型原果胶酶与B型原果胶酶。前者主要作用于原果胶的内部的多聚半乳糖醛酸区域。而后者主要作用于外部的连接聚半乳糖醛酸链和细胞壁组分的多糖链。

2.2多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonases)

聚半乳糖醛酸酶是在有水环境下促进聚半乳糖醛酸链水解的一种果胶酶，应用最为广泛。根据水解作用机理不同，它可以分为内切聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.15)和外切聚半乳糖醛酸酶(E.C.3.2.1.67)。外切酶又可以划分两种类型：一种是真菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的终产物是单体半乳糖醛酸；另一种是细菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的终产物是二聚体的半乳糖醛酸。

2.3裂解酶(pectin lyases，PL)

裂解酶(反式消去酶)是通过反式消去作用裂解果胶聚合体的一种果胶酶，裂解酶在C-4位置上断开糖苷键，同时从C-5处消去一个H原子从而产生一个不饱和产物。根据其作用机理以及作用底物的不同，裂解酶可以划分为：①内切聚半乳糖醛酸裂解酶(EndoPGL，

E.C.4.2.2.2)；②外切聚半乳糖醛酸裂解酶(ExoPGL，E.C.4.2.2.9)；

③内切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(EndoPMGL，E.C.4.2.2.10)；④外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(ExoPMGL)。

3、果胶酶产生菌

目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌[5, 6]，也有链霉菌产生果胶酶的报道[7]。在细菌中，欧文氏杆菌(Erwinia sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、节杆菌(Arthrobacter sp.)和假单胞杆菌(Pseodomonas sp.)都产生果胶酶。嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方面，应用前景可观，受到较多的关注和研究。已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属，如曲霉属(Aspergillus sp.)、灰霉菌属(Botrytis sp.)、镰孢菌属(Fusarium sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、核盘菌属(Scletorium sp.)和玉圆斑菌属(Cochliobolus sp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中，而曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，如用于果汁、果酒及中药营养液的深加工等，使得产品质量和外观得以改善，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶，而且黑曲霉属于安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内，

这也是其被应用于食品工业行业中的原因之一。

A型原果胶酶主要来源于酵母及酵母状真菌的发酵液中。研究人员已经从Kluyveromy cesfragilis

IFO0288. Galactomyces reesei L.和Trichosporon penicilla- tum SNO 3[8]中分离出了原果胶酶．依次称为原果胶酶-F，-L和-S(PPase-F.-L.-S)，另外从Bacillus subtilis IFO12113，B．subtilis IFO3134和Tramete sp.菌株中分离出了B-型原果胶酶[8]，依次称为原果胶酶-B，-C和-T(PPase-B，-C和-T)。

内切聚半乳糖醛酸酶广泛分布于真菌和细菌中，在一些高等植物和寄生于植物的线虫中我们也发现了此种酶。据报道，现在已经在许多微生物的菌体中发现了这种内切酶，包括Aureobasidium pullulans，Rhizoctoniasolani Kuhn，Fusarium moniliforme，Neurospora crassa，Rhizopus stolonifer，Aspergillus sp，Thermomyces lanuginosus，Peacilomyces clavisporus等。科研人员已经在大量的微生物种类中，对内切聚半乳糖醛酸酶进行了克隆复制，在遗传学方面进行了大量的研究。相对而言，产生外切聚半乳糖醛酸酶的微生物较少。已经报道的产生外切活性酶的微生物有：Erwiniacarotovora,Agrobacterium tumefaciens,Bacteroides thetaiotamicron，E．chrysanthemi，Altemaria mali，Fusarium oxysporum，Ralstonia solanacearum，Bacillus sp.等[9-11]。

聚半乳糖醛酸裂解酶(PGLs)可以由多种细菌和一些致病性的真菌产生，内切聚半乳糖醛酸裂解酶比外切聚半乳糖醛酸裂解酶要丰富。可以从腐烂食物中的细菌和真菌中分离到PGLs。据报道，从Colletotrichum lindemuthionum，Bacteroides thetaiotaomicron，Erwinia cartovora，A mucala sp，Pseudomonas syringae pv．Glycinea, Colletotrichummagna,E．chrysanthemi，Bacillus sp，Bac illus sp．DT-7，C. gloeosporioides

等[12,13]菌株中可以分离到此种酶。相比之下关于聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGLs)的产品却鲜于报道，仅有少数报道指出我们可以从As．pergillusjaponicus，Penicillium paxilli，Penic illium sp．，Pythium splendens，Pichia pinus，Aspergillus sp．，Thermoascusauratniacus中分离到此种酶[13-16]。

３、果胶酶的理化性质

3.1果胶酶活力检测方法

掌握可靠的酶分析定量方法是开展果胶酶研究工作的重要前提。果胶酶的测定方法很多，各具特点，且酶活单位的定义不同，要根据不同情况加以选择对比。常用的酶活力测定方法有[17]：

3.1.1滴定法

滴定法主要用于测定果胶酯酶的活力，根据该酶作用机制，采用滴定羧基来评价酶活。果胶酯酶的活力还有一种测定方法，即，通过气相色谱或液相色谱仪定量分析甲醇，根据甲醇的生成量来评价酶活，此方法比较精确但要求较高。

3.1.2黏度下降法

黏度下降法基于果胶物质在酶的作用下大分子降解伴随底物溶液黏度下降这一事实，以底物黏度下降的百分比来评价酶活。该方法所测定的酶活性，主要是反映内切酶酶活。

3.1.3脱胶作用时间法

该方法根据果胶物质在未被酶解之前以及在酶解反应的不同时期能在异丙醇溶剂中形成大小不等的胶团而判断酶的活性。该方法最能反映内切水解酶和内切裂解酶两种酶在实验条件下的综合能力。

3.1.4还原糖测定法