模式生物酵母菌

• 细胞生命活动中的许多过程诸如酶催化代 谢反应、信号转导、蛋白质的修饰与加工、 蛋白质的转运等都表现为一种蛋白质与另 一种蛋白质间的相互作用. 传统的免疫印迹、 W e s te rn b lo t 等方法很难满足对蛋白质 分子之间相互作用这一动态过程的研究需 要. 利用酵母转录因子的特点，F ie ld s 和 S o n g 于1989 年创立了一种非常简便而 有效的研究蛋白质相互作用的方法———酵 母双杂交系统。
大肠杆菌遗传学研究应用 • 大肠杆菌的生活周期很短，并且单个细胞 可以很容易的获得一个遗传上同源的细胞 群体（克隆）. 细菌是单倍体，这意味着即 使是隐性突变，也能够表现出突变的表型， 同时细菌之间可以方便地进行遗传物质的 交换，细菌的这些特征便于对其进行遗传 学研究.
• 大肠杆菌作为生命科学研究的模式系统， 其主要优势是具有遗传交换系统. 遗传交换 使定位突变、构建含多种突变的菌株、构 建用来辨别显性突变和隐性突变及进行顺 反式分析的部分双倍体的菌株成为可能. • 这种遗传交换系统主要通过两种方式构建 的.
模式生物--大肠杆菌、酵母菌
张红霞
大肠杆菌简介
• 大肠杆菌（E s c h e ric h ia c o li ），是相对 简单的单细胞原核生物，所有D N A 、 R N A 和蛋白质合成的机器都包含在同一 细胞器中，可以相对容易的培养和操作。
酵母菌简介
• 酵母菌（Y e a st）是一群以芽殖或
产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母
整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建
Bgl II PARS2 Bgl II 5’ AOX1 HBsA g pBSAG1 51 11 kb PHIS 4 Bgl II 3’ AOX1
转化his-的受体细 胞
重组分子 染色体 DNA
his+的转化 子
5’
HBsA
PHIS 4
• 利用重组酵母生产乙肝疫苗
• 由乙型肝炎病毒（H B V ）感染引起的急慢性乙型肝炎是
一种严重的传染病，每年约有200万病人死亡，并有3亿 人成为H B V 携带者，其中相当一部分人可能转化为肝硬 化或肝癌患者。目前对乙型肝炎病毒还没有一种有效的治 疗药物，因此高纯度乙型疫苗的生产对预防病毒感染具有 重大的社会效益，而利用重组酵母大规模生产乙型疫苗为 其广泛应用提供了可靠的保证。
• 第二种方式是通过噬菌体介导的转导，噬 菌体成熟时有一部分噬菌体的D N A 被寄 主D N A 所取代，当噬菌体感染下一个细胞 时，从以前寄主那里获得的染色体D N A 片段可以和被感染的寄主染色体发生重组， 导致遗传信息从一个细胞转移到另一个细 胞。
酵母菌遗传学研究应用 • 在酵母系统中，单倍体和双倍体细胞的存 在促进了酵母的遗传分析. 酵母在单倍体和 二倍体的状态下均能生长，并能在实验条 件下较为方便地控制单倍体和二倍体之间 的相互转换，这种转换是通过交配（单倍 体到双倍体）和孢子生成（双倍体到单倍 体）来实现的，这对其基因功能的研究十 分有利. 例如，要想知道一个特定的基因是 否是细胞生长所必需的，可以在单倍体里 敲除这个基因，单倍体细胞只能承受非必 需基因的敲除。
工程菌及载体 • 基因工程菌为β-半乳糖苷酶缺陷型菌株。 这种宿主菌的染色体基因组中编码β-半乳 糖苷酶的基因突变，造成其编码的β-半乳 糖苷酶失去正常N 段一个146个氨基酸的短 肽（即α肽链），从而不具有生物活性，即 无法作用于X -g a l 产生蓝色物质。 • 用于蓝白斑筛选的载体具有一段称为la c z ' 的基因，la c z '中包括：一段β-半乳糖苷酶 的启动子；编码α肽链的区段；一个多克隆 位点(M C S )。
• 第一种方式是大肠杆菌通过性结合交换 D N A ，大肠杆菌的育性质粒（F 因子， F -fa c to r ）具备把自身从一个细胞转移到 另一个细胞的能力. F 因子介导的结合是 一个复制的过程，F +细胞转移一个拷贝的 F 因子给F -细胞. 有时，F 因子整合到染 色体中，就会引起寄主染色体通过接合向 F -细胞转移. • 含有整合的F 因子的菌株叫做H fr 菌株 （高频重组菌株，H fr s tra in ），这种材 料对于进行遗传交换研究非常有用。
够制成900万份乙肝疫苗。
酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 酵母菌表达外源基因的优势
全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简便 具有原核细菌无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵历史悠久、技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中
不含有特异性的病毒、不产内毒素，美国FDA认定为安全的 基因工程受体系统（Generally Recognized As Safe GRAS）
• 在20 世纪60 年代末，H a rtw e ll 、 H u n t 和N u rs e 便认识到用遗传学 方法研究细胞周期的可能性. H a rtw e ll 采用酿酒酵母细胞建立系 统模型，经过一系列试验，分离出细 胞周期基因发生突变的酵母细胞，相 继发现了一系列与细胞周期调控相关 的C D C 基因（c e ll d iv is io n c y c le g e n e s ）。
酵母菌是最简单的真核模式生物
应用前景
• 酵母中容易对其基因组做精确的人为突变， 当把末端与基因组的任何一个特定区域同 源的线性D N A 引入到酵母细胞中，酵母 基因组就会发生非常高的同源重组，导致 目标染色体序列被所用的目的染色体片段 所取代. 如精确地删除整个基因的编码区、 改变单个特定的密码子，甚至改变启动子 中一个特定的碱基对，这使得研究基因或 其调控序列的功能等具体问题变得比较容 易.
酵母双杂交系统
• 最突出的特点是可以在酵母这种生长 迅速且易操作的体系中研究真核细胞 的蛋白质-蛋白质相互作用，而且还可 通过c D N A 文库筛选直接找到与未知 蛋白质相互作用的蛋白质的基因。
• 近年来为了适应更广泛的用途，在原有酵 母双杂交系统基础上发展了大量的衍生系 统，如蛋白质三杂交系统、激酶三杂交系 统、小配体三杂交系统、R N A 三杂交系 统等类型. 此外，还出现了为研究膜蛋白的 相互作用而改进的S O S 富集系统（S O S re c ru itm e n t s y s te m ，S R S ），在该 系统中，蛋白质之间的相互作用被人为限 制在酵母细胞膜上。
α-互补 • 缺陷株基因无法单独编码有活性的β-半乳 糖苷酶，但当菌体中含有带la c z '的质粒后 ，质粒la c z '基因编码的α肽链和菌株基因组 表达的Ｎ端缺陷的β-半乳糖苷酶突变体互 补，具有与完整β-半乳糖苷酶相同的作用 X -g a l 生成蓝色物质的能力，这种现象即α互补。
•
操作中，添加IP T G (异丙基硫代-β-Ｄ-半乳糖 苷)以激活la c z '中的β-半乳糖苷酶的启动子，在 含有X -g a l 的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。 以上是携带空载体的菌株产生的表型。当外源 D N A （即目的片段）与含la c z '的载体连接时， 会插入进M C S ，使α肽链读码框破坏，这种重组 质粒不再表达α肽链，将它导入宿主缺陷菌株则无 α互补作用，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分 解培养基中的X -g a l 产生蓝色，培养表型即呈现 白色菌落。
大肠杆菌基因组 • 大肠杆菌通常只有一条染色体，比高等生 物的基因组要小得多，并且具有较高的基 因密度（大约每1 k b 就有一个基因），没 有内含子和很少有重复D N A ，易于寻找和 分析基因.
酵母菌基因组 • 通过对酵母全基因组序列测定，其基因组 大小约为12 M b ，初步确定了5 885 个编 码蛋白质的基因，140 个rR N A 基因、 275 个tR N A 基因，第一次揭示了一种真 核生物的全部基因的数目和大体上的功能 分类. 酵母基因组中有将近31％编码蛋白质 或者具有开放阅读框，与哺乳动物编码蛋 白质的基因有高度的同源性。
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实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同 使用的。含X -g a l 的平板培养基中同时含有 一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生 素，这样，一次筛选可以判断出：未转化 的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体 ，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转 化了重组质粒的菌，即目的重组菌，长成 白色菌落。
酵母基因工程
裂殖方式进行无性繁殖的单细胞真核
生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母 菌）、担子菌纲（担子酵母菌）、半 知菌类（半知酵母菌），共由56个 属和500多个种组成。 • 如果说大肠杆菌是外源基因最成熟的 原核生物表达系统，则酵母菌是最成 熟的真核生物表达系统。
ห้องสมุดไป่ตู้
• 酿酒酵母（S a c h a ro m y c e s c e re v is ia e ）是第一种至少在一万年 前就能被人工培育的真菌，是最简单的真 核生物，是由一个细胞组成的独立的生物 个体，能在基本培养基上生长，易于培养 和操作，被称为真核生物中的“大肠杆 菌”。 早在1996年就完成了酿酒酵母的基 因组测序，这是人类第一次获得真核生物 基因组的完整核苷酸序列，被称为遗传学 研究上的一座里程碑。
3’ AOX1
AOX1 g
•
重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油 耗尽后，加入甲醇诱导乙肝病毒的表面抗原多肽 （H B sA g ）表达，最终S 蛋白的产量可达细胞 可溶性蛋白总量的3%在大规模的生产过程中，巴
斯德毕赤酵母工程菌在一个240L 的发酵罐中培
养，最终可获得90克22nm 的H B sA g 颗粒，足
• 酵母与其它真核生物相比，它们的基因组较 小（约12 M b ），基因数目也比较少（约5 885）.与大肠杆菌类似，它们可以在实验 室里快速繁殖，在理想条件下，每次细胞分 裂大约90 m in ，可以从单个细胞繁殖成克 隆群体. 酵母作为模式实验系统最重要的优 点是，酵母细胞不仅简单，而且具有所有真 核生物细胞的主要特征，如含有一个独立的 细胞核、多条线性染色体包装成染色质、细 胞质包含了全部的细胞器（如线粒体）和具 有细胞骨架结构（如肌动纤维蛋白）等.
• 一种被称为“S T A R T ”的基因对控制各个 细胞周期的最初阶段具有决定性的作用. N u rs e 在H a rtw e ll 的基础上，发现了调 节细胞周期的一种关键物质C D K （细胞周 期蛋白依赖激酶），并证明C D K 是通过 对其它蛋白质的化学作用（磷酸化作用） 来驱动细胞周期. 鉴于利用酵母分子遗传学 对细胞周期调控理论的巨大贡献，H u n t 、 H a rtw e ll 和N u rs e 荣获了21 世纪的首 届诺贝尔生理医学奖.
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的优势
大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征
大肠杆菌表达外源基因的劣势
蓝白斑筛选
筛选原理
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野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以 将无色化合物X -g a l (5-溴-4-氯-3-吲哚β-D -半乳糖苷)切割成半乳糖和深蓝色的物 质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养 菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和 筛选的最直观有效的方法。
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应用
利用重组大肠杆菌生产人胰岛素
• 1982年，美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人 胰岛素，成为世界上第一个上市的基因工程药物。 • 由基因工程菌合成的重组人胰岛素在体外胰岛素受体结合
性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、
血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别， 而且还具有无免疫原性、注射吸收迅速等优点，充分展示 了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。