第八章-亲和分离

适合于带有氨基的配基如蛋白质的偶联。
（b）环氧化物法 常采用环氧氯丙烷和二羟基正丁烷双缩水甘油醚 （BGE）做活化剂，活化后的载体可以直接与R－OH、 R－SH 、 R－NH2 偶联(直接法), 但反应速度慢，一 般需要24h以上。 间接法：环氧基团进一步活化，然后偶联配基
（c）三嗪法 均二氯三嗪或三氯三嗪（氰尿酰氯）可活化多 羟基的介质。单氯三嗪基—多糖复合物，在pH7-9 及0-20℃条件下，可和含有伯胺之类亲和配基偶联 。
引入间臂分子最常用的方法: 先将间臂分子氨烷基化合物NH2(CH2)nCOOH、 NH2(CH2)n NH2连接到载体上。 然后将亲和配基连接在间臂分子上。
羧基和氨基在碳二亚胺的作用下可以缩合形 成酰胺键。 间臂的长度是很重要的因素，太短，效果不 明显；太长，间隔臂容易弯曲，结合效果会下降。 实验结果表明，一般引入4－6个亚甲基时，间臂 分子效果较好，常用的间臂分子为ω-氨基己酸、 1，6-二氨基己烷。
www.nyteknik.se/.../bioteknik/article36093.ece
• 固定化金属离子亲和层析 （Immobilized metal affinity chromatography，IMAC）
Jerker Porath
Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+ 等过渡金属离子可与N、S、O产 生配位键，可与蛋白表面的组氨酸（His）的咪唑基、半胱 氨酸（Cys）的巯基、色氨酸（Trp）的吲哚基结合。 金属离子与His的咪唑基结合力最强。 金属离子与咪唑基结合的强弱顺序： Cu2+> Ni2+ >Zn2+>Co2+ 金属离子可通过一个螯合基团固定在层析介质上 ，用于 蛋白质的分离。 常用的螯合亚氨基二乙酸(IDA)、次氨基三乙酸(NTA)。
（d）高碘酸盐法 高碘酸钠(NaIO4)可将多糖基质上相邻的 连二醇基氧化成为醛基，醛基与氨基反应生 成不稳定的Schiff碱，然后将Schiff碱还原。
聚丙烯酰胺载体的活化与偶联
（a）戊二醛法
（b）肼法 肼法特别适用于含有酰胺基载体的活化， 在肼的作用下，酰胺基变成酰肼基，然后在 亚硝酸的作用下生成叠氮化合物，最后与含 氨基的配基偶联。
• 8.4 亲和沉淀
• 1）水溶性分子上偶联多个配基，与目标分子形成 网络交联形成沉淀。 • 2）二次作用 • 水溶性亲和介质结合目标分子后，通过改变物理 场（如调节pH离子强度等）使其共沉淀。
• 8.5亲和双水相萃取
• 对PEG进行修饰，偶联亲和配基（如染料分子）， 可使分配系数大幅度提高。
• 8.6 分子印迹技术
• 染料亲和层析
三嗪类色素是一类含有三嗪环的活性染料。
这类染料的结构和NAD的结构相似，能与以NAD为 辅酶的脱氢酶和激酶结合。 最常用的活性染料为 Cibacron Blue F 3GA。
洗脱方法：
①增加盐浓度（NaCl）洗脱 ②改变pH洗脱。 ③采用辅酶NAD进行洗脱
NAD
• 以 底物、抑制剂为配基的亲和层析 如： 谷胱甘肽-Sepharose 可用来纯化谷胱甘肽 S转移酶（亲和配基为底物），并可用于重组 的谷胱甘肽S转移酶融合蛋白的纯化。 大豆胰蛋白酶抑制剂、精氨酸、赖氨酸、 苄眯为亲和配基可纯化胰蛋白酶（亲和配基 为抑制剂） 。
E L EL
K eq [ EL ] [ E ][ L ]
E—蛋白质
L—配基
亲和作用分子对中被固定的分子称为配基(ligand) 结合常数越大，亲和作用越强 合适 104～108L/mol 生物素(biotin)－抗生物蛋白(avidin) 1015L/mol 不可逆
8.2 亲和色谱
利用偶联有亲和配基的层析介质为固定相， 根据生物分子之间的亲和作用进行物质分离的液 相色谱方法。
第8章 亲和色谱
• 亲和纯化技术 • 利用生物亲和作用（bioaffinity）进行分离 纯化的技术。 • 生物亲和作用：生物分子能够区分结构和 性质非常接近的其它分子，选择性地与其 中某一种分子相结合。
• 常见的亲和作用：
– 抗体和抗原 – 酶和底物（或抑制剂） – 金属离子和特殊基团形成配位键，如咪唑基 （组氨酸）和Ni2＋形成金属螯合结构。
http://courses.cm.utexas.edu/jrobertus/ch339k/overheads-1/ch5_affinity.jpg
• 1. 亲和吸附介质
• 载体(matrix)
• 要求：亲水、多孔、稳定性高、机械强度高、含可活化的反应基团、 粒度均一。
• 亲和配基(ligand)
硅胶与多孔玻璃的活化与偶联
活化方式采用硅烷化试剂进行，如γ-环氧基 丙氧基－三甲氧基硅烷、γ-氨丙基三甲氧基硅烷。 硅烷化试剂将环氧基团或氨基引入无机材料上， 可进一步采用相应方法固定配基。
间隔臂
当配基的分子量较小的时候，如果将其直接 固定到载体上，会由于空间位阻的影响，配基与 生物大分子不能发生有效的结合。 这时需要在配基和载体之间引入一个间臂分 子，使配基和生物大分子发生有效作用。
3. 常用的亲和层析方式 • 核苷酸及辅酶亲和层析 以核苷酸（或辅酶）作为亲和配基，用于纯 化各种脱氢酶和激酶。 常用的辅酶：NAD、NADP、ATP AMP、ADP的腺苷部分与辅酶的结构类似， 同样可作为脱氢酶和激酶的亲和配基。
蛋白质的洗脱一般用辅酶或核苷酸进行洗 脱，如采用NADH梯度洗脱3-磷酸脱氢酶和乳 酸脱氢酶。
2. 亲和层析的洗脱方式
• 特异性洗脱 采用含有与亲和配基或目标产物具有亲和 结合作用的小分子化合物的溶液为洗脱剂，通 过与与亲和配基或目标产物竞争性结合洗脱目 标产物。 特异性洗脱条件一般比较温和，有利于保 护目标产物的生物活性 • 非特异性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子 种类或温度等理化性质降低目标产物吸附作用 的洗脱方法。
• 凝集素亲和层析
凝集素是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外） 的总称。 伴刀豆球蛋白A (Con A) 是从刀豆中分离出的一种植 物凝集素，它和含有D-甘露糖苷，葡萄糖苷的分子有亲 和性，可用于糖蛋白、多糖和糖脂的分离纯化。还可以 用于细胞的分离纯化。 Con A 亲和层析的解吸一般采用竟争性配基洗脱，如 采用甲基甘露糖苷或甲基葡萄糖苷进行梯度洗脱 。 常用的凝集素配基还有麦芽凝集素（WGA）等。
http://www.biol.uw.edu.pl/zbm/bmkoment_pliki/image010.jpg
金属离子亲和层析只和蛋白质表面的组氨酸等 氨基酸有关，和蛋白质中总组氨酸数量无关，可分 辨到1个组氨酸，层析分辨率较高。 对于重组蛋白，可在重组蛋白N端或C端加入6 个组氨酸，表达后的蛋白可采用IMAC进行高效的 亲和纯化，组氨酸标签的纯化甚至可以在8M尿素或 6M盐酸胍的变性条件下进行，最常用的离子是Ni2+ 。
– – – – – 酶抑制剂 抗体 辅酶：辅酶I，II… 色素：含三嗪环的染料… 金属离子：Cu2＋、Ni2＋ 、 Zn2＋ 、 Co2＋等
• 间隔臂(spacer)
• 配基分子量小时，由于空间位阻，蛋白质不能与配基有效结合。需在 配基和载体之间连接一个“手臂”。 • 长度有限制，超过一定长度，亲和力会减弱。
• 螯合剂：去除金属离子，破坏配位键。
2.亲和作用体系
特异性
抗原－抗体
亲和体系
高度专一性 酶－底物、产物、抑制物
核酸－互补碱基链、核酸结合蛋白 激素－受体蛋白
类别专一性 酶－辅酶（如NAD+、NADP+）
IgG － Protein A、Protein G 酶、蛋白质－活性染料 酶、蛋白质－过渡金属离子（如Cu2＋、Ni2＋） 凝集素－糖、糖蛋白、细胞
亲和配基要求：
配基与被分离生物大分子之间的专一性识别或特异 性作用，必须是可逆的。 配基与被分离分子之间结合力要有足够高，以能形 成稳定的复合物；同时结合又不能太强，否则洗脱 困难。 固定到载体上后配基的专一性识别或特异性作用不 发生明显的变化。
载体的活化与偶联
多糖类载体的活化与偶联 常用的方法有溴化氰法、三嗪法、高碘酸盐法、 环氧化物法等 （a）溴化氰活化 活化多糖载体中最为常用的方法，其反应时间短， 只需要几分钟至几十分钟。溴化氰是剧毒药品，活化 操作必须在通风橱中进行。
与固定床吸附操作类似。 – 进料（feedstock loading） – 杂质清洗（contaminant washing） – 目标产物洗脱（target product elution） – 色谱柱再生（column regeneration）
• 对大多数亲和层析，一步可以达到很高的纯化倍数。 • 特异性高的亲和层析洗脱只出一个峰，对亲和作用选 择性较低的分离，可用梯度和阶梯洗脱分离目标产物
IMAC的吸附条件: 在pH值为6.0-9.0吸附 IMAC的解吸附： ①将pH降低到3.0-4.0进行洗脱 ②竟争性洗脱，采用能与金属离子发生作用的物 质如咪唑、组氨酸等进行洗脱 解吸后需要对层Βιβλιοθήκη Baidu柱进行再生，再生一般采用 EDTA。EDTA不但可以解吸蛋白质，而且将所有结 合在层析介质上的金属离子也一起接洗脱下来。
影响亲和作用的因素
• 离子强度：影响静电引力。离子强度越大，静电力和 氢键力都降低。
• pH：影响静电引力。
• 抑制氢键形成的物质：脲、盐酸胍可抑制氢键的形成。 但也容易使蛋白质变性。
• 温度：温度升高，静电力、氢键、金属配位键减弱， 疏水力增强。 • 离液离子：SCN-，I-，ClO4-等离子半径较大的离液阴 离子，疏水作用降低。
1. 亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联到载体的表面即可制备亲 和吸附介质。 常用层析介质并不能直接和亲和配基化学结合， 一般先要进行活化或功能化，即要引入反应基 团。
活化后的层析介质能够通过反应基团和亲和配 基反应，从而制备出亲和层析介质。
载体要求： – 具有亲水、多孔结构； – 含有可活化的反应基团； – 理化性质稳定，不因共价偶联反应的条件及 吸附条件的变化而发生变化； – 非特异吸附小。 多糖类的凝胶过滤介质表面含有大量可活 化的羟基可作为亲和配基的载体。 表面具有氨基的聚丙烯酰胺类的载体也常 作为亲和配基的载体。 还可采用一些无机载体如硅胶和多孔玻璃。
• 免疫亲和层析
以抗体或抗原为亲和配基，纯化特异性抗原或 抗体。 抗体可为多抗和单抗。 用作亲和配基的抗体对抗原的结合力不能太 强，中等强度适合。 免疫亲和层析最常用的洗脱方法为降低pH 至2~4。
• Protein A/Protein G亲和层析
蛋白A（protein A）来源于金黄色葡萄球菌的细 胞壁，而蛋白G（protein G）来源于G群链球菌。 蛋白A和蛋白G可与IgG的Fc片断结合，作为亲 和配基可用于抗体的分离纯化。
蛋白A、蛋白G与不同属来源的抗体结合强度不同 pH8.0 结合在亲和柱
洗脱方法为降低pH至2.5~3之间。
8.3 亲和膜分离
• 层析柱高对操作压力影响很大，极限的粗矮层析 柱为单层颗粒，在膜表面固定配基即为亲和膜。
• 优点：传质阻力小，达到吸附平衡的时间短，配基利用率 高，压降小，流速快，设备体积小，成本低。但存在理论 板数低，膜污染和堵塞等问题。
http://www.chem.reading.ac.uk/dept/staff/org/wh1.gif
• 下一节——电泳
8.1 生物亲和作用
1. 亲和作用的本质 • 结构：钥匙和锁孔的关系 • 作用力：
– 静电作用：近距离产生较大的作用力，但应与其它因素结合才能 具有亲和识别作用。 – 氢键：分子中的氧原子和氮原子，可形成氢键作用。与原子间距 离有关，应较近。 – 疏水性相互作用：需两分子都具有疏水性基团。 – 配位键：咪唑基（组氨酸）和Zn2＋、Cu2＋、Ni2＋等产生配位键， 形成金属螯合结构。 – 弱共价键：可逆共价键，结合力较弱。