反义寡核苷酸化学修饰酶类药物的研究进展

反义寡核苷酸化学修饰酶类药物的研究进展

[关键词]：化学修饰,靶向技术,序列选择,靶向转运

摘要：

反义寡核苷酸（antisense oligodeoxynucletide,as ODN）类药物是人工合成并经化学修饰的寡核苷酸（ODN）片段，能通过自身设计的特定序列与靶 mRNA 结合，在基因水平干扰致病蛋白的产生。由于其高度的选择性和较低的副作用，as－ODN类药物已成为近年来药物研究和开发的热点。最近，as -ODN类药物福米韦生（fomivirsen,Vitravene）通过美国FDA批准为第一个进入市场的反义药物。其他asODN类药物ISIS2302，ISIS3521／CGP64128A和 G3139等在临床试验中也表现出良好的疗效。

as－ODN作为基因表达的反向抑制剂，首先必须具备三个主要条件：即它应有足够的稳定性、对目的基因的选择性以及对细胞的通透性和靶向性。满足三个首要条件的方法主要是针对ODN在化学修饰、序列选择、靶向转运等方面加以改善。

反义寡核苷酸的化学修饰

不经修饰的ODN不论在体液内还是细胞中都极易被降解，不能发挥其反义作用。因而采用经化学修饰的ODN，以减少核酸酶对ODN的降解。对ODN化学修饰的方法主要针对三方面，即碱基修饰、核糖修饰和磷酸二酯键修饰。碱基修饰主要为杂环修饰、5-甲基胞嘧啶和二氨基嘌呤；核糖修饰主要为己糖。2’－O-甲基取代核糖、环戊烷、α构象核糖；磷酸二酯键修饰主要为硫代和甲基代修饰等。

其中硫代寡核苷酸（phosphorothioate，PS－ODN）、混合骨架寡核苷酸（mixed backbone oligonucleic acid， MBO）和多肽核酸（peptide nucleic acid，PNA）应用广泛，成为具有代表性的第一、二、三代ODN。

硫代寡核苷酸

由于磷酸二酯键是核酶的主要靶点，因此采用硫化试剂将ODN磷酸二酯键硫化成为PS-ODN类结构，是增强ODN稳定性的有效途忡。PS ODN是迄今研究最深入、应用最广泛的一类as ODN。作为第一代as-ODN药物，PS－ODN只有良好的水溶性、稳定性及易于大量合成，基本能满足临床治疗的需要。与天然OON相比，PS－ODN通过细胞内吞作用进入细胞内平衡所需时间更长，最终细胞内浓度也更高；其t1/2一般都大于24h，极大地提高了对核酸酶的耐受能力。PS－ODN抑制基因的表达通过两种方式，即诱导Rase H以降解目的 mRN或与目的mRNA形成杂交体而干扰mRNA的加工和翻译。其副作用主要来自其携带的负电荷和免疫原性：由于PS－ODN带有大量的负电佝，能与多种因子结合从而导致非特异效应。体外实验表明， PS－ODN及其核酸降解物能与血清蛋白、细胞表向受体结合，或者进入细胞内与某些碱性蛋白质或酶结合，产生非特异效应。另外研究还发现，PS-ODN 及其核酸降解物中含有多个连续的胞苷磷酸鸟苷（CgG）序列，会产生非序列特异性的抑制作用。

混合骨架寡核苷酸

MBO是人们根据不同修饰的OON特性而加以各种组合设计而成。与PS-ODN 相比，MBO通过不同化学修饰的组合降低了硫代磷酸二酯键的数量，减少了自身携带的负电荷，降低了体内降解速度并改变了核酸降解物的种类，从而减少了由硫代导致的副反应；提高了与靶mRNA的结合能力并提高诱导RNaseH降解mRNA 的能力。Zhang 等在大鼠试验中，静脉给药后MBO在多种组织中均有分布，给药48h后主要仍以完整的形式存在；比对照的PS-ODN在体内的稳定性、体内各组织的分布、代谢等方面均有提高；仍观察到一些轻微副作用，如部分酶原凝血时间延长、淋巴细胞增殖、有浓度依赖的补体溶血作用等，但程度要小于相同剂量的PS-ODN。

多肽核酸

PNA结构上是以2-氨基乙基甘氨酸为基本单元，碱基通过一个甲基联基与类肽链骨架相连。由于结构PNA与DNA类似，其两相邻碱基间距及碱基与类肽链骨架间的距离均相近， PNA与DNA以及RNA与PNA之间均可形成Wat son-Crick 配对。体外试验证明，PNA与RNA结合可抑制逆转录过程，与双链DNA发生链侵入反应后，可有效阻断限制性内切酶对酶切位点的识别和切割，从而阻断蛋白的表达。与前两代as-ODN相比，PNA具有更强的亲和力及更好的特异性，往往更短的片段即可获得相同的反义效果；具有良好的蛋白酶和核酸酶抗性，在细胞培养液及体内不易降解，半衰期更长；经修饰后具有良好的细胞膜穿透性，其应用前景广阔。

反义寡核苷酸的序列选择

as-ODN必须与靶mRNA互相结合形成杂交分子才能发挥对目的基因的反向抑制作用，因而as ODN与其靶mRNA结合的亲和力成为其发挥反义效力的首要因素。从理论上讲，与mRNA互补的 ODN序列越长，其结合能力越强。但事实上，较长的ODN难以通透细胞膜并极易被降解，无法发挥反义作用。而且，体内的mRNA 分子结构上具有高度的分子折叠，并含有大量结合的偶联蛋白，人们很难预测那些未理藏起来易于as-ODN接近的序列。

对于体内mRNA结构的复杂性，人们在as-ODN 靶序列的选择上通常选择一些优先序列：例如选择启动子编码区附近或翻译起始区作为靶序列；在原核生物中，针对SD（Shine-Dalgarno）序列及其附近区域的阶as-ODN更有效；在真核生物中，针对5’端非编码区可能比针对编码区的as-ODN更有效。

如果在优先区域选择靶序列不能成功，或者其他区域的选择更有价值，则需采用其他的方法确定靶序列：例如Bacon等采用"Walk"法确定敏感序列，从5’端到3’端合成一系列ODN，然后检验其反义能力，这种方法是有效的，但是人力物力投资巨大；Milner等在合成系列ODN基础上，检测它们与兔β-球蛋白mRNA形成异二聚体的能力，方法简单，但由于mRNA的折叠在体内和体外有很大不同，其实用价值还有待于进一步的体内验证；Ho 等采用半随机化ODN文库，探索具有RNaseH作用部位的候选mRNA靶序列，对ODN序列进行有效预计，结果