辣根过氧化物酶的结构与作用机制

厚的兴趣 ;还有部分学者推测该区域对催化反应中 体 ,以及启动一个以该产物为底物的反应 。
但其实辣根的根部含有很多此酶的同工酶 ,而“辣 根过氧化物酶 ”则是这些同工酶的总称 ,其中以辣 根过氧化物酶同工酶 C (HRP C)的含量最为丰富 。 以 HRP C为题发表的文章不计其数 ,其中本文所要 介绍的有关 HRP C结构和作用机制的研究直到最 近才被阐明 。 1990 年 , Sm ith 等 [ 1 ]成功获得了重组 HRP C,并用 X射线解答了其三维结构 ;到 1997年 , Gajhede等 [ 2 ]详细阐述了 HRP C催化循环中的催化 中间体 ;接着众多的研究报告论述了 HRP的作用机 制及生理作用 。为了更详细地了解 HRP在植物体 内的特殊作用 ,许多学者以与辣根同为十字花科的 拟南芥 (A rabidopsis tha liana )作为代表植物来进行 研究 。目前 ,已有两个研究小组测定了整个拟南芥 过氧化物酶的基因序列 ,它至少包含 73个完整的基 因 ,预计其中大多数基因都能表达成酶 ,而且可能其 中的每个过氧化物酶同工酶都能参与一种不同的生 理作用 [ 3, 4 ] 。 1. HRP的结构
●小综述 文章编号 : 100021336 (2005) 0120033203
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辣根过氧化物酶的结构与作用机制
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洪伟杰 张朝晖 ห้องสมุดไป่ตู้国营
( 浙江工业大学生物与环境工程学院 , 杭州 310014 )
粒 ,分别针对 HBV 基因组中的 p、s、x、c、preS 基因 , 以及重 复 序 列 DR1、DR2。将 这 些 质 粒 分 别 转 染 HepG2细胞后 ,筛选能够持续表达 shRNA 的细胞 , 接着转染编码 hbv基因组的质粒 ,结果使 HBV DNA 拷贝数和 RNA 水平显著降低 。Ying等 [ 14 ]人工合成 针对 HBV c基因的小分子干扰 RNA ( siRNA ) ,转染 分别产生野生型和 YMDD 变异型 HBV 的细胞株 HepAD38、HepAD79,结果使病毒 DNA 含量显著降 低 ,且抑制效果在两种细胞株之间无明显区别。 Hamasaki等 [ 15 ] 将 带 有 S ap Ⅰ黏 末 端 的 线 性 HBV DNA 转染 HuH7和 HepG2 细胞株 ,以起始 HBV 的 完整复制周期 ;将人工合成针对 c基因的 siRNA 转 染细胞 ,转染后 2天培养液中 HBeAg含量较对照组 低 4～5倍 ,而 HB sAg无明显变化 , 3. 5 kb mRNA 水 平显著降低 ,而 2. 4 kb /2. 1 kb mRNA 水平无明显变 化 ,表明这种抑制作用是特异性的 。
量的 siRNA 观察到非特异性抑制作用 。 十多年的临床实验证明 ,基因治疗总体上是安
全有效的 。去年来 ,慢性乙型肝炎基因治疗的研究 也取得了另人鼓舞的成绩 ,然而作为一种常规的治 疗方法应用于乙肝 ,仍存在很多问题 ,如疗效 、所需 费用 、副作用等 。随着理论和实践技术研究的深入 , 这些问题会被逐步突破和改进 。基因治疗应用于乙 肝 ,将会得到越来越多人的认可 。
图 1 HRP C的一些结构特征 [6 ]
中存在着一个共有的区域叫过氧化物酶折叠中心 , HRP和其他第三类过氧化物酶在该中心上都有 3 个 α螺旋 。其中 2个 α螺旋 ( F′螺旋和 F″螺旋 )的 氨基酸序列和种类都表现出了很强的可变性 ,但由 于 Cys177与 Cys209之间存在着一个二硫键 ,使 F′螺旋 和 F″螺旋所组成的区域在整体结构上保持了相对 稳定 。由于 F′螺旋可能存在着底物的结合位点和
M cCaffrey等 [ 16 ]将编码 hbv基因组的质粒和能 够体内生成 shRNA 的质粒转染免疫缺陷型和健全 型小鼠 ,从 4 个方面显示对 HBV 的抑制作用 : ( 1 ) 血液中 HB sAg的含量较对照组降低 ; (2)肝脏中 hbv RNA 含 量 明 显 下 降 ; ( 3 ) 检 测 不 到 肝 脏 中 HBV DNA; (4 ) 肝脏中 HB cAg含量也明显降低 。 Giladi 等 [ 17 ]用针对 s基因的 siRNA 和编码 hbv基因组的质 粒同时注射 BALB / c小鼠得出相似结论 , Giladi还发 现 siRNA 对病毒的抑制效果呈剂量依赖性 ,过高剂
参考文献
[ 1 ] Zhang L et a l. B ioelectrochem istry, 2004, 63 ( 1 - 2) : 369—373 [ 2 ] Gregoriadis G et al. V accine, 2002, 20: B1—B9 [ 3 ] Chen L et al. In t Imm unopharm acol, 2004, 4 ( 3) : 403—409 [ 4 ] Shao HJ et a l. A cta V irol, 2003, 47 ( 4) : 217—221 [ 5 ] Kwissa M et al. J M ol M ed, 2003, 81 ( 2) : 91—101 [ 6 ] 赵 平 等. 生物化学与生物物理进展 , 2002, 29 ( 4 ) : 576—
1. 1 二维结构 辣根过氧化物酶同工酶 C是一 条由 308个氨基酸组成的肽链 ,它的氨基酸序列已 经由 W elinder等 [ 5 ] 测定 。N 末端联着一个固定的 吡咯烷酮羧基 , 而 C 末端联着的丝氨酸却经常丢 失 。在这条肽链中有 4个由两分子半胱氨酸组成的 二硫键 ,它们分别是 11～91、44～49、97～301和 177 ～209;同时还存在一个由 A sp99和 A rg123组成的盐 桥 。整条主连上共有 9 个潜在的糖基化位点 ,而其 中的 8个已经被占据 。在整个多糖分子中 ,一个含 有 7个单糖的残基占了总体的 75% ～80% ,但是整
482 —484 [ 15 ] Hamasaki K et a l. FEB S L ett, 2003 ( 543) : 51—54 [ 16 ] McCaffrey AP et a l. N a t B iotechnol, 2003, 21 ( 6) : 639—644 [ 17 ] Giladi H et a l. M ol Ther, 2003, 8 ( 5) : 769—776
582 [ 7 ] Woo PC et a l. V accine, 2001, 19: 2945—2954 [ 8 ] D ing CL et a l. W orld J Gastroen terol, 2003, 9 ( 7) : 1512—1515 [ 9 ] Hoep rich S et a l. Gene Ther, 2003, 10 ( 15) : 1258—1267 [ 10 ] Pan WH et a l. M ol Ther, 2004, 9 ( 4) : 596—606 [ 11 ] Morrissey DV et al. J V ira l Hepa t, 2002, 9: 411—418 [ 12 ] 沃健儿 等. 浙江大学学报 , 2003, 23 (2) : 112—115 [ 13 ] Ying C et al. B iochem B iophys R es Comm un, 2003: 398—404 [ 14 ] Ying C et al. B iochem B iophys R es Comm un, 2003 ( 309 ) :
摘要 : 辣根过氧化物酶是一种重要的酶制剂 ,它已经有一个多世纪的研究历史了 。近几年 ,有关它的结构 、催化中间 体 、催化机制以及特殊氨基酸残基功能等又有了新的发现 。 关键词 : 辣根过氧化物酶 ; 血红素 ; 糖基化 中图分类号 : Q55
辣根 ( horseradish)是一种长年生香草 ,在世界 大部分温和地区都有种植 。它的根不但可以烹调 ,
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通道 ,使许多研究 HRP的学者对该区域表现出了浓 引起更复杂的反应 ,包括形成二倍体 、三倍体 、多聚
收稿日期 : 2004211226 作者简介 : 洪伟杰 ( 1980—) ,男 ,硕士生 , E2mail: peter - hong@ sina. com; 张朝晖 ( 1968—) ,男 ,博士 ,副教授 ,硕士生导师 ; 芦国营 (1980—) ,男 ,硕士生
同时还含有一种含量丰富的过氧化物酶 。这种酶含 有血红素 ,能利用 H2O2 氧化许多有机及无机化合 物 。由于这种酶的商业用途广 ,例如 :可作为临床诊 断和免疫测定的一种试剂等 ,人们开始大量地从辣 根的根部来提取这种酶 。虽然这种酶常用“辣根过 氧化物酶 ”( horseradish peroxidase)这个词来形容 ,
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●M in i R e view s
着两个空白区域 ,该区域可能是由钙结合位点与其 他结构元素共同作用而成的 ,也可能是基因复制后 留下的产物 。
1. 3 HRP与植物过氧化物酶超家族的结构关系 植物过氧化物酶超家族包括细菌过氧化物酶 、真
菌过氧化物酶以及植物过氧化物酶 , HRP属于植物 过氧化物酶超家族的第三类 。在这三类过氧化物酶
个多糖的构型却由于其他单糖的变化而变化 。在这 些小的单糖中 ,两端的 GlcNAc 和中间的一些甘露 糖残基却是固定不变的 。单糖在糖基化位点上构型 的变化也使整个多糖的构型变得更为复杂 。HRP C 中的多糖组成在某种程度上取决于酶的来源 ,但一 般多糖的分子量占总酶的 18% ～22% [ 6 ] 。 HRP C含有两个不同的金属中心 :正铁原卟啉 (即血红素 )和两个钙原子 。这两个金属中心对酶 的整体结构和功能都是非常重要的 。通过血红素中 铁原子的一个轴向结合点与肽链上 H is170侧链的 N 原子结合 ,使血红素垂直连接在 H is170上 (图 1 ) ;而 卟啉铁的另一个轴向结合点在静态酶中则是空着 的 ,当有 H2 O2 存在时 , 该结合点就能与 CO、氰化 物 、氟化物或叠氮化物等小分子结合 。这些小分子 中有些是以质子化了的形式存在的 ,这样它们还能 通过氢键与 A rg38和 H is42结合 ,使这些小分子更加 稳定 。在血红素平面的上下两侧存在着两个钙原子 的结合位点 ,它们通过一个氢键群与血红素结合区 域相连 。每个钙原子都是 7 供氧配合体 ,它们能同 时与主肽链上含羰基的氨基酸 ,侧链上的 A sp、Ser 和 Thr,以及一个末端结构水分子结合 。钙离子的 丢失将会导致 HRP C酶活和热稳定性的下降 [ 7 ] ,还 能使血红素的构型发生改变 。 1. 2 三维结构 最早确定 HRP C三维结构的是 在 1997 年 [ 2 ] 。在此之前 ,由于不同来源的 HRP C 所含多糖成分的差异 ,使测定 HRP C三维结构的试 验一直处于失败中 ;随后 Gajhede等改以重组 HRP C为研究对象才使该研究得以成功 。如图 2 所示 , 酶的结构总体上看来大部分是 α螺旋 ,但其中也包 含一些小的 β折叠 。在血红素平面上下两侧存在