分子生物学DNA复制

注意事项:
①DNA的 GC含量同样 影响其密度
② OD260的应用：
DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50μg/ml双链DNA 40 μg/ml单链DNA 33 μg/ml寡核苷酸
判断核苷酸样品的纯度 DNA纯品：OD260/OD280=1.8 RNA纯品：OD260/OD280=2.0
5` TA 3` AT n
36.7 ℃
＜＜
5` AT 3` TA n
57.02 ℃
※ 嘌呤嘧啶的排列顺序对双螺旋结构（稳定性）的影响
Pyrimidine-Purine Steps Have Little Base Stacking
5’ C
T 5’
3’ A
G
3’
5’ CA 3’ 3’ GT 5’
Purine-Pyrimidine Steps Have Extensive Base Stacking
2. 双螺旋的主链
每一单链具有 5‘ →3’极性
两条单链极性 相反 反向平行
两条单链间以 氢键连接
碱基互补
C-G
T-A
以中心为轴， 向右盘 旋（直 径2nm）
碱基是扁平结 构，位于内部， 成对且垂直于 螺旋轴
双 螺旋中存 在大，小 沟
3. 双螺旋模型参数
· 直径20Å · 螺距为34Å（任一条链
最早在SV40和多瘤病毒
中发现
超螺旋是所有线性或环
形DNA的共有的重要特征
The supercoils of the SV40 minichromosome can be relaxed to generate a circular structure, whose loss of histones then generates supercoils in the free DNA.
3、影响 Tm值的因素
（1） 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 ，决定于GC含量 GC%愈高 →Tm值愈大；GC%愈低→Tm 值愈小
（2）GC%含量相同的情况下
AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小
碱基排列对Tm值具有明显影响
5` GC 3` CG n
136.12 ℃
＞＞ Tm
5` CG 3` GC n 72.55 ℃
其中α 和β 、β 和γ 之间是高能磷酸键
第二节 DNA结构
一、DNA分子的一级结构
(DNA sequence)
多聚核苷酸链
3’
主链是核糖和磷酸
5’
侧链为碱基
由3’,5’磷酸二酯键连接
链的方向：同一个磷酸基 的3’酯键到5’酯键的方向 (5’→3’)
5’-UCAGGCUA-3’
= UCAGGCUA 默认书写顺序5‘→3’
C、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的 主链的脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在 生理条件下离解为负离子 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象
一级结构的概念 指DNA分子中的核苷酸排列顺序，通过3’,5’-磷酸二酯键
相连形成的线形结构 不同生物借此贮存遗传信息 决定DNA的二级结构和高级结构
超螺旋结构的方向性
B-DNA
紧缠overwinding (右旋)
导致左手超螺旋
正超螺旋 （positive supercoiled ）
B-DNA
松缠unwinding (左旋)
导致右手超螺旋
负超螺旋 （Negative Supercoiled ）
所有生物的DNA几乎 有5%为 Negative Superhelix ?!
DNA一级结构的特点
a、脱氧核糖是其显著特点
－－－－DNA极其稳定的根本原因
酮式
烯醇式
酮式
烯醇式
DNA在酸性条件 下的稳定性？！
RNA 在高pH时则稳定性很差 ——由于2’－OH导致的水解
12-18h
碱
如：<37℃, 0.3MKOH,1h
2’, 3’-环式单核苷酸 OH 自由的 5’-OH
b、磷酸呈四面体构型，脱氧核糖呈折叠的五元环，碱基是平 面的
素、 酰胺 )，低盐浓度等
2、变性过程的表现
¤ 是一个爆发式的协同过程，变性作用发生在一个很 窄的温度范围
¤ 导致一些理化性质发生剧烈变化 ※ 熔液黏度降低 ※ 沉降速度加大 ※ 浮力密度上升 ※ 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，在260nm的吸收值先是 缓慢上升，达到某一温度时及骤然上升
超螺旋状态的描述
数学公式描述 L = T + W (α = β + γ)
Vinograd 方程式
L 连接数（Linking number ） cccDNA分子两链的交叉数
T 盘绕数（Twisting number ） 双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数
W 超螺旋数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数
一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低
4、 常用的变性方法
☆ 热变性 应用广泛，特别是用于变性动力学研究
缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链 ☆ 碱变性
pH11.3时，全部氢键被淘汰 无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法
◎ 保存单链DNA的条件
保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L
W= 负值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix）
体外可产生正超螺旋
核苷酸 磷酸核糖骨架
渗入的分子
360o-26o/helix / One of EB inserted
In vitro EB inserted cccDNA
Neg. → Pos. Superhelix change
d、 1952 M.H.F.Wilkins & Rosalind Franklin 得到了高度定向的DNA纤维的X-射线照片 发现原子长轴存在0.34和3.4nm两种周期性
此外，之前的密度测定表明螺旋由两条多核苷酸链组 成，且直径恒定（2nm)。
1953. Watsosn & Crick
DNA结构的3种模型
L= T+W W = L - T = 正值 DNA向紧缩方向发展
负 Superhelix OC, L, DNA 正 Superhelix
0
0.05
0.1
第三节 DNA的物理、化学性质
一、DNA分子变性 (DNA denaturation)
1、条件：ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱD.S. DNA
S.S. DNA
加热, 极端pH,有机溶剂（ 尿
polymer
OC L CCC
Svedberg Unit (S)
D.S. L 1.00 D.S. OC 1.14 S.S. L 1.30 D.S. CCC 1.41 Collapsed 3.00
EB对超螺旋结构的影响
L (linking Num.)不变 T (Twisting Num.)减少 (-26o/helix / 0ne of EB inserted)
base
base
3.4埃 base
EB 7.0埃
base
base
局部DNA 的紧缩
base
不同构型的DNA沉降系数和迁移率不同
Linear DNA. L Open Circle DNA OC relexed form
Supercoiled circle(高级结构) Covalent Closed Circle CCC
第二章 基因的分子特性
核酸的化学组成 核酸的二级结构 DNA的理化性质 超螺旋和真核染色
体的组装
第一节 遗传物质特性
多聚核苷酸的化学本质
☉ 碱基 Nitrogenous bases
嘧啶Pyrimidines
Uracil (U)
嘌呤Purines
☉ 核糖 The sugars of nucleic acids
片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小 （5） 变性液中含有尿素，甲酰胺等
尿素，甲酰胺与碱基间形成氢键 改变碱基对间的氢键 Tm 值可降至40℃左右
（6）盐浓度的影响 单链DNA主链的磷酸基团
负电荷的静电斥力
两条单链DNA的分离
Na+在磷酸基团周围形成的电子云 对静电斥力产生屏蔽作用
减弱静电斥力
OD A260
A
B
Z
表 2.1 A、B 及 Z 型螺旋的主要特征概括
A型
B型
螺旋方向 直径 每匝螺旋碱基数（n） 每对碱基旋转角度（360/n） 每对碱基螺旋上升（h） 螺距 碱基对与中心轴倾角 大沟 小沟 糖苷键
右手 约 2.6nm 11 33? 0.26nm 2.8nm 20? 乍，深 宽，浅 anti
右手 约 2.0nm 10 36? 0.34nm 3.4nm 6? 宽，深 乍，深 anti
5’ A C
3’
3’
G
T
5’
5’ AC 3’ 3’ TG 5’
生物体内仅UAA为最有效的终止密码子
因为： UAA 的Tm值是最低的一个，即使生 AUU 理温度下也不稳定
（3） 大片段D.S DNA分子之间比较
片段长短对Tm值的影响较小, 与组成和排列相关 （4） 小于100bp 的 D.S DNA分子比较
Concentration 50μg/ml
Opetical Density
dNTPs A260 = 1.60 S.S DNA A260 = 1.37 D.S DNA A260 = 1
OD 1.37
1.185
1.0
℃
Tm (melting temperature) = midpoint of the temperature range over which DNA is denatured = OD增加值的中点温度(一般为85-95℃)
0.01M
Na+
0.1M
1.0M
Tm 静电斥力 熵值（△S）
当Na+浓度低
屏蔽作用小
斥力加强
Tm ↓
当Na+浓度高
屏蔽作用大
斥力减弱
碱基溶解性降低 疏水作用力增加
熵值(△S)上升
Tm ↑
（7） 极端pH条件的影响
pH ~ 12 酮基 → 烯醇基
改变氢键的形成与结合力
pH ~ 2-3 NH2 → NH2+ (质子化)
二、 DNA分子的复性 （anneal or renaturation）
D.S DNA
Denaturation ▲ ▼ Renaturation
S.S DNA
复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA )
二、 DNA双螺旋模型结构（double helix model）
1.双螺旋结构提出背景依据 a、 1938. W. T. Astbury 首次用X－射线分析DNA
b、 1950 Chargaff A + G / T + C = 1 A+T ≠ G + C
c、 1952 Alexander Todd 发现了核苷酸和核苷酸之间由磷酸二酯键联接
绕轴一周所升降的距离） · 每圈有10个核苷酸
（碱基）
· 两个碱基之间的垂直
距离是3.4Å。螺旋转 角是36度 · 有大沟和小沟 配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称
Rise 3.4 Å
Pitch 34 Å 10.4 bp/turn
Minor Groove
Major Groove
Marmur-Doty formula
1x SSC ( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate )
GC% = 30-70%
Tm = 69.3 + 0.41 × GC%
OD 1.37
1.185
what is meaning ?
1.0
℃
Tm1 ＜ Tm2
Evaluation GC% of DNA
☉ 核苷（nucleotide）
嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子
糖苷键 Glycosidic bond
9
核糖是戊糖
1’
RNA－核糖核苷(R=OH)
DNA－脱氧核糖核苷(R=H)
☉ 核苷酸（nucleotide acid）
核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸
γβα
CMP NMP
dATP dNTP
序列
Any
Any
存在的条件
DNA-Na crytic D.S RNA
DNA/RNA
Normal
Z型
左手 约 1.8nm 12（6 个二聚体） 60? 0.37nm 4.5nm 7? 平坦 乍，深 anti（嘧啶） syn（嘌呤） 嘌呤、嘧啶交替 排列 4M Na+
三、超螺旋（superhelix OR supercoil）
Width 20 Å
◘ 大、小沟的差异
O,N:氢键受体a NH2：氢键供体d
⊕大沟中碱基差异容易识别,往往是 蛋白质因子结合特异DNA序列的位点
⊕ 小沟相对体现的信息较少
大沟(a-d-a) 小沟（a-a）
大沟(a-a-d, d-a-a) 小沟（a-d-a）
4.双螺旋结构的基本形式
A
B
Z
Base Inclination Handedness