谷胱甘肽测定方法研究进展_范崇东

谷胱甘肽测定方法研究进展

范崇东1

,王淼

1,2*

,卫功元3,黄玲

1

(11江南大学食品学院食品生物技术学科组;21江南大学工业生物技术教育部

重点实验室;31江南大学生物工程学院环境生物技术研究室,江苏无锡214036)

摘要:对分光光度法、酶法、荧光法、电化学法以及和HPLC 等测定方法的原理、发展和应用作了详细叙述,同时对其它方法也作了简单介绍,最后对谷胱甘肽测定方法的发展作了展望。

关键词:谷胱甘肽;测定;分析;进展

中图分类号:TQ46417,R91411 文献标识码:A 文章编号:1004-311X(2004)01-0068-03

收稿日期:2003-07-02;修回日期:2003-08-05

基金项目:江苏省高校高新技术产业发展项目(编号:JH02-101)

作者简介:范崇东(1978-),男,江苏南通人,硕士生,从事生物活性物质的分离纯化、酶制剂在食品中的应用研究;*通讯作者:Tel:510-

5869552,E-mail:mwang@ 。

1 谷胱甘肽的性质及分布

谷胱甘肽(L -C -谷氨酰-L -半胱氨酰-甘氨酸,Glu -tathi one)是一种同时具有C -谷氨酰基和巯基的生物活性三肽化合物,其相对分子质量为307.32,熔点189~193e (分解),晶体呈无色透明细长柱状,等电点为5.93。它易溶于水、烯醇、液氨和二甲基甲酰胺,但微溶于醇、醚和丙酮等。作为机体内重要的生物活性巯基物质,谷胱甘肽对于维持生物体内合适的氧化还原环境起着至关重要的作用。临床上,谷胱甘肽可以迅速提高机体免疫力,在抗氧化、抗辐射、清除自由基、解毒、促进铁质吸收等方面具有良好的效果且无副作用;在食品加工领域,谷胱甘肽具有增强食品营养价值和强化食品风味等功能。自1921年Hop kins 首先发现GSH 以来,科学家们一直研究它在各种生物体内的生理作用,其中GS H 在人体各种组织细胞中的含量以及与各种疾病、组织损伤的关系至今

仍然是研究的热点[1]

。

谷胱甘肽在自然界中分布很广,动物组织、许多植物如蔬菜、豆类、谷物、薯类、菇类,以及部分微生物中均有谷胱甘肽存在,其中酵母、小麦胚芽中含量比较丰富。另外,人和动物的血液中也含有较多的谷胱甘肽。作为生物体内的非蛋白巯基化合物,谷胱甘肽主要有还原型(GSH)和氧化型(GSSG)两种形态,在机体中大量存在并起主要作用的是还原型谷胱甘肽,其分子结构见图1。

2 谷胱甘肽的测定方法

从20世纪50年代起,研究者就开始建立谷胱甘肽的各种测定方法,直到本世纪初,仍然有很多改进方法和新颖的技术方案不断涌现。随着分析技术的不断进步,在测定专一性、精确度、灵敏度和速度等方面都有明显提高。纵观谷胱甘肽的测定方法,形式多样,原理也不尽相同。可见分光光度法、酶法、荧光分光光度法、高效液相色谱法等是最主要和常用的方法,其它如差热扫描(DSC)、红外检测等方法虽然不常用,但是在研究工作中也有一定价值。

图1 G SH 的化学结构

Fi g.1 Chemical Structure of GSH

生物样品中谷胱甘肽的测量是一个复杂的问题,主要存在以下几个问题[1]:生物样品的复杂性问题。生物样品的组成往往十分复杂,其中包括各种蛋白质、氨基酸、多肽及其它非蛋白类物质,这些物质对谷胱甘肽的测定常常有很大的影响,如基于巯基测定的方法会因为其它物质巯基的存在而干扰测定,往往造成实际的检测结果偏大[2];GS H 和GSSG 间的氧化还原平衡问题。GSSG 既可因GSH 氧化而高估,亦可因GSSG 还原成GSH 而低估,准确测量GSH 、GSSG 的关键依赖于对样品的科学处理和快速有效的GSH 提取技术等。此外谷胱

甘肽的其它存在形式如GSSX 、ProSSG 等也会影响到检测的准

确性[3]

;GS H 的稳定性问题。GS H 稳定性受到温度和pH 等环境因素的限制,从而影响测定结果。不同的生物样品体系中由于各种物质在组成上的差异,造成各体系测定的条件和方法各异,甚至会截然不同。如果忽视这些因素的存在,将会给测定结果带来一定的影响[4];生物样品往往对于样品的体积,样品的GSH 、GSSG 浓度方面有一定限制,尤其是GSSG,在生物样品中的浓度往往只有GS H 的1/20~1/40,微量、痕量的测定

给实验带来难度[5]

。随着研究深入,对测定方法的要求已经向分子水平发展,同时生化研究中大量样品的测定都要求在尽可能短的时间内完成。如何来解决干扰、稳定、测定速度等问题成了测定方法研究的热点之一。2.1 分光光度法

分光光度法作为最早的谷胱甘肽测定方法之一,其原理是基于Ellman 试剂(5,5-二硫双(2-硝基苯甲酸),DTNB)[2]与巯基的反应。作为巯基定量检测的方法,DTNB 在p H 8.0下和巯基反应,生成4-硝基苯硫酚化合物,其离子呈黄色,在412nm 处有强烈的吸收峰,而DTNB 本身在400nm 以上几乎没有吸收峰。因此,向试样中加入少量的DTNB,在412nm 处测定生成物浓度,根据吸光值的大小即可求得试样中的巯基含量。

图2 DTNB 和GSH 的反应

Fig.2 The Reaction Scheme between DTNB and GSH

但是由于该反应对GSH 没有专一性,其它巯基物质的存

在使得测定误差随着样品的不同而有较大变化,所以有一定的局限性,要采用此法进行更为精确的测定,必需依靠优良的分离技术。

此外,还有一些利用其它发色机理来进行测定的方法。Sanger 试剂(FDNB)可以和氨基反应显色,也有基于茚三酮反应的显色方法,Shinji Ohmori 等还建立了基于氨基乙酸残基显色反应的比色方法等。

2.2 谷胱甘肽还原酶循环法(GR-DTNB)

基于Ell man 建立的方法[3],1969年Tietze 建立了谷胱甘肽还原酶循环法,该方法在Ellman 试剂显色的基础上,添加了氧化型谷胱甘肽的还原反应(如图3),NADPH 的加入使得Ellman 反应中生成的GSSG 不断被还原成GS H,使得反应液的颜色不断加深,在4min 范围内颜色的变化速率和TGSH(Total Glu -tathione)的浓度成正比,在405n m 或者412nm 下测得颜色的增加值,通过标准曲线计算出样品中谷胱甘肽的含量。GR -DTNB 法可以用于各种生物样品的测定,如全血、红血球、组织抽提液、人体的肝脏和唾液等。实际应用表明其它物质对测

第14卷第1期:682004年2月 生 物 技 术BIOTECHNOLOGY

Vol 114,No 11:68

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