7未知病原菌的分离鉴定

Widal test (5人/组)
材料： 病人未知血清：1#，2#，3# 菌液：O、H、PAH、PBH（已知Ag） 方法：每组1块多孔板/24支试管； 每人2支吸管；
方法
1
NS 菌液(摇匀)
(4种,1种/人)
弃0.5ml于消毒缸
2
0.5
3
0.5
4
0.5
5
未知病原菌的分离鉴定
病原菌检测程序
初步诊断
形态结构 直接涂片、染色、镜检 分离、鉴定 观察培养特征、形态特征
生化试验(书p17-18) 血清学试验(玻片凝集法) 动物试验(产毒性、分离) 药物敏感试验 病原菌抗原检测 分子生物学技术(核酸杂交、PCR、基因芯片
核酸 )
其他检测技术
临床标本中未知病原性球菌的分离鉴定程序
– 其他：革兰染液、靛基质试剂、玻片等
实验方案
尿液
离心沉淀 1500转，10分钟
第1次
分离培养 （EMB平板）
革兰染色
第2次
革兰染色
克氏双糖铁斜 面培养基
动力-靛基质-尿素半 固体琼脂培养基
第3次
观察结果
观察结果
完成靛基质试验
实验材料
粪便
– 标本：肛拭子（1#、2#）
– 培养基：
• EMB平板 • 克氏双糖铁斜面培养基 • 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
进程安排
– 实验分3次进行
实验材料
脓汁 – 标本：脓拭子 – 培养基：血琼脂平板 – 其他：3%H2O2、兔血浆、生理盐水、革兰染液、 玻片等
实验方案
脓拭子
第1次课
分离培养 （血平板）
革兰染色
第2次课
革兰染色
触酶实验
血浆凝固酶实验
实验操作与观察
触酶实验：
1. 挑取菌落置玻片上； 2. 滴加1～2滴3%H2O2，观察结果；
直接涂片、革兰染色、镜检(形态,排列,染色性) 临床标本
血琼脂平板/巧克力血琼脂平板(菌落性状,溶血性,色素)
可疑菌落
涂片,染色,镜检 纯培养 生化反应 致病性测定 药敏试验
思考：如何从脓拭子、咽拭子中分离并鉴定病原性球菌？
查病原
脓血便、肛拭子
标本
SS平板,中国兰,EMB
选择/鉴别培基
双糖发酵, 橘橼酸 盐利用试验,尿素, 靛基质试验……
此次实验成功或需要改进的地方；
其他
预习：肥达反应
实验报告 临床标本中病原菌的分离与鉴定
班级 ________ 组别 ____ _____ 姓名 _________ 学号 _________ 日期 ________
材料 1. 待检标本： 2. 培养基： 3.其他： 方法
结果
（包括对结果的分析、结论以及尚需追加实验等） 讨论
肥达试验 (Widal test)
用已知的伤寒沙门菌O、H抗原 、甲型副伤寒沙门菌、肖氏、希 氏沙门菌H抗原的诊断菌液，与 患者血清作定量凝集试验，检测 患者血清中的相应抗体，辅助诊 断伤寒、副伤寒。
Georges Widal in 1896 (French)
Widal test
正常值：
诊断伤寒：O凝集效价>1:80, H凝集效价>1:160; 诊断副伤寒：O凝集效价>1:80, H凝集效价>1:80 才有诊断价值. 动态观察：抗体效价随病程延长而上升； 双份血清升高4倍或以上； O与H抗体的诊断意义： O↑，H↑---肠热症(伤寒或副伤寒)的可能性大 O↓，H↓---患病的可能性小 O不高，H↑---预防接种 / 非特异性回忆反应 O↑，H不高---感染早期或与伤寒沙门菌O抗原有 交叉反应的其他沙门菌感染 少数病例在整个病程中，肥达试验始终呈“-”: 早期使用抗生素治疗或患者免疫功能低下
二、方法 (实验程序) 三、结果 四、讨论
实验目的
– 熟悉临床标本中常见病原菌的分离鉴定程序 – 学习脓汁、痰、粪便、尿液等临床标本的检查方法
实验要求
– 针对病例，对临床标本中的病原菌进行分离和鉴定 – 实验前制定方案，实验后写出实验报告
实验分组
– 5人/组 – 1套标本/组（脓汁、痰、尿液、粪便）
血清学鉴定
玻片凝 集试验
生化反应
未知肠道杆菌的分离鉴定程序
伊红美蓝平板--- EMB
Eosin-methylene blue agar,EMB
克氏双糖铁试验
Double sugar iron slant
枸橼酸盐利用试验
Citrate slant
吲哚试验
Indole broth
玻片凝集
设计性实验
2. 直接在菌落上加一接种环去氧胆酸纳溶液
3. 将平板37℃孵育20～30分钟，观察结果
实验操作
荚膜染色：石炭酸复红单染
1.涂片、自然干燥、火焰固定；
2.1滴石炭酸复红，立即冲去，镜下观察。
实验材料
尿
– 标本：尿液 – 培养基：
• EMB平板 • 克氏双糖铁斜面培养基
• 动力-靛基质-尿素半固体琼脂培养基
临床标本中病原菌的分离与鉴定
一、材料： 5人/组
3块/组 3块/组 3支/组 3支/组
1.待检标本： 脓拭子、咽拭子、尿液标本、肛拭子1#、肛拭子2# 2.培养基：血平板
EMB平板 克氏双糖铁斜面 动力-靛基质-尿素半固体
3.其他：革兰染液、玻片、10%胆盐、靛基质试剂、NS、兔血浆、
3%H2O2、沙门氏菌多价血清、志贺氏菌多价血清
实验方案
咽拭子
第1次
分离培养 （血平板）
革兰染色
第2次 第3次
革兰染色 荚膜染色
胆汁溶菌实验
奥普托辛实验
观察奥普托辛实验结果
实验操作
奥普托辛实验：
1. 挑取菌落涂于血平板上，将optochin纸片贴于接种处； 2. 37℃培养18～24小时，观察结果。
实验操作
胆汁溶菌实验（平板法）：
1. 在血平板上标记单个菌落
– 其他：生理盐水、靛基质试剂、沙门菌多价血 清、志贺菌多价血清、玻片等
实验方案
肛门拭子1、2
第1次
EMB平板
第2次
克氏双糖铁斜 面培养基
动力- 靛基质- 尿素 半固体琼脂培养基
第3次
观察结果
观察结果 完成靛基质试验 玻片凝集试验
讨论内容
针对实验步骤的讨论；
对结果的分析； 还需要进一步做哪些实验；
+
触酶实验
实验操作与结果
凝固酶实验：
1. 取生理盐水于玻片上，挑取待检菌置于生理 盐水中，制成菌悬液，观察有无自凝现象。 2. 向菌悬液中加1滴兔血浆并混合，观察结果。
+ 血浆凝固酶实验
实验材料
痰 – 标本：咽拭子 – 培养基：血琼脂平板 – 其他：生理盐水、10%胆盐、Optochin纸片、 革兰染液、玻片等