实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定参考PPT
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碱性磷酸酶Km值的 ppt课件
[S]：底物浓度 V：不同[S]时的反应初速度 Vmax：最大反应速度(maximum velocity) Ｋm：米氏常数(Michaelis constant)
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
8
实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
9
7
注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
1
2
3
4
5
加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
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9:02:30 9:03:00
碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
碱性磷酸酶Km值的
4
Km值 ① Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时 的底物浓度。 ② 意义： a) Km是酶的特征性常数之一； b) Km可近似表示酶对底物的亲和力； c) 同一酶对于不同底物有不同的Km值。
9:17:30 9:18:00
保证每个试管的反应时间为15分钟
碱性磷酸酶Km值的
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实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
碱性磷酸酶Km值的
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注意事项
• 1 底物和酶取样准确 • 2 保温时间准确
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加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
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碱性磷酸酶Km值的测定
碱性磷酸酶Km值的
1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
碱性磷酸酶Km值的
2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
碱性磷酸酶Km值的
3
Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
酸性磷酸酯酶基础实验
实验一 酶促反应与时间的关系——初速度时间范围测定[原理]酸性磷酸酯酶（Acid phosphatase E.C.3.1.3.2）广泛分布于动物和植物中，植物的种子、霉菌、肝脏和人体的前列腺中。
它对生物体核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢，骨的生成与磷酸的利用，都起着重要的作用。
酸性磷酸酯酶是酶动力学研究的好材料。
它能专一性水解磷酸单酯键。
本实验选用绿豆芽作材料，从中提取酸性磷酸酯酶。
以人工合成的对-硝基苯磷酸酯(NPP)作底物，水解产生对-硝基酚和磷酸。
在碱性溶液中，对-硝基酚盐离子于405nm 处光吸收强烈，而底物没有这种特性。
利用产物的这种特性，可以定量地测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。
即测定单位时间内405nm 处光吸收值的变化，来确定酸性磷酸酯酶的活性。
酸性磷酸酯酶一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol 产物所需的酶量。
要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。
可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。
本实验进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。
从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。
随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。
要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。
求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。
[试剂和器材] 1、试剂：（1）酸性磷酸酯酶原酶液取萌发好的绿豆芽，剪去根的头部，称取豆芽茎20g ，用蒸馏水洗干净，用研钵研碎，加0.2mol/L 乙酸盐缓冲液4mL ，置冰箱6小时以上。
将上述绿豆芽浸液倒入纱布内压榨，榨出液3 000r/min 离心15min ，上清液置透析袋对蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h 以上。
将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽茎克数相等，以3 000r/min 离心30min ，所得的上清液即为原酶液，置冰箱待用。
生化试验
实验十六酸性磷酸酶K M及Vmax值测定一、实验目的（1）掌握米氏常数K M值和Vmax值的测定原理（2）掌握分光光度计的使用方法二、实验基本原理（1）酸性磷酸酶存在于人体的肝脏、前列腺等组织中，也存在于某些细菌及处于发芽阶段的植物种子中。
（2）本实验所采用的酸性磷酸酶一般是由绿豆芽或小麦胚芽等制备的，并以酸性苯二钠为底物，进行酶反应动力学的实验分析。
本实验的反应方程式：（3）酸性磷酸酶一个活性单位等于在反应的最适条件下，每分钟生成1µmol 产物所需的酶量。
（4）本实验首先通过实验绘制酶反应时间与产物生成量之间的关系曲线，从中确定酶活性测定所需的最合适时间范围，然后在pH=5.6，反应温度35℃的条件下，将不同浓度的底物与固定量的酶进行反应，通过实验测得反应初速度（V0），最后通过1/[S]与1/V0作图，即Lineweaver-Burk双倒数作图法，求得酸性磷酸酶的K M值和Vmax值。
三、实验试剂与器材1、试剂（1）0.2mol/L，pH=5.6醋酸缓冲溶液（2）酶液（3）5mmol/L磷磷酸苯二钠溶液（4）1mol/L碳酸钠溶液（5）Folin-酚试剂2、器材（1）恒温水浴槽（2）可见光分光光度计四、实验操作步骤（1）取7支试管，分别做上记号，依次标上0、1、2、3、4、5、6（2）按下表向7支试管加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，再用0.2mol/L，pH=5.6醋酸缓冲溶液将试管加至0.5mL管号 1 2 3 4 5 6 05mmol/L磷酸苯二钠/mL 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50 0.2mmol/L，pH=5.6醋酸缓冲溶液/mL 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 -- -- 酶液/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 -- 1mol/LNaCO2溶液/mL 2 2 2 2 2 2 2 Folin-酚稀溶液/mL 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 酶液/mL -- -- -- -- -- -- 0.5(3)将7支试管至于35恒温水浴箱，再加入酸性磷酸酶液（稀释液）0.5mol,摇匀，再逐管加入Folin-酚稀溶液0.5mL。
碱性磷酸酶Km值的ppt课件
精选课件
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加入酶的时 间
加入碱性溶液 终止反应的 时间
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保证每个试管的反应时间为15分钟
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实验报告
• 1 绘制矩形双曲线图
• 2 绘制双倒数图，并通过双倒数图读出碱 性磷酸酶对磷酸本二钠的Km值
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注意事项
• 1 做如下表格
1234 5 6 7 Abs [S] 1/ABS 1/[S]
• 2 可电脑作图
• 3 若人工作图，在坐标轴上禁止出现分数(1/2,1/16)
• 4 实验的最终目的是测得Km值，因此实验报告最终 必须得出结论：Km值等于多少
碱性磷酸酶Km值的测定
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1
影响 酶促反应的因素
底物浓度 酶浓度 pH 温度 激活剂 抑制剂
※ 研究一种因素的影响时，其余各因素均恒定。
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2
底物浓度对反应速率影响
在其他因素不变
V
的情况下，底物浓度
对反应速率的影响呈
矩形双曲线关系。 [S]
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Ｖ ── ＝ Vmax[S] Km + [S]
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V Vmax Vmax/2
Km
❖ Km
Vmax ＝ Vmax[S]
《酸性磷酸酶的》课件
基因克隆与表达
基因克隆
通过分子生物学技术，从生物体中提取酸性磷酸酶基因的全 长或部分序列，并在实验室中进行复制。
基因表达
将克隆的酸性磷酸酶基因转染至适当的细胞或生物体中，使 其表达产生相应的蛋白质。
基因突变与功能研究
基因突变
研究酸性磷酸酶基因突变对其功能的 影响，包括酶活性、底物特异性等方 面的变化。
功能研究
通过体外实验和体内实验，深入了解 酸性磷酸酶在生物体内的生理功能和 作用机制。
基因治疗与药物研发
基因治疗
利用酸性磷酸酶基因或其相关分子进行治疗，以纠正或补偿某些遗传性疾病或病理状态 。
药物研发
基于酸性磷酸酶的特性，开发具有治疗作用的新型药物，用于癌症、感染性疾病等的治 疗。
06 酸性磷酸酶的未来研究方 向与展望
低副作用。
抑制剂的优化
02
对已有抑制剂进行结构优化，以提高其选择性、稳定性和口服
生物利用度。
抑制剂的作用机制研究
03
深入探讨酸性磷酸酶抑制剂的作用机制，为进一步的药物设计
和优化提供理论支持。
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药效学特性
抑制剂对酸性磷酸酶的抑制作用具有选择性，对其他酶的影响较小。抑制剂的作 用强度与抑制常数（Ki）成反比，Ki越小，抑制作用越强。
药代动力学特性
抑制剂在体内的吸收、分布、代谢和排泄过程受多种因素影响。药物的生物利用 度、半衰期、血药浓度等药代动力学参数对药物的疗效和安全性具有重要影响。
05 酸性磷酸酶的基因工程研 究
它具有一些重要的特性，包括 对pH值的敏感性，通常在酸性 环境下表现出较高的活性。
此外，酸性磷酸酶还具有底物 特异性，只作用于特定的磷酸 酯底物。
实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 制作酶反应时间 反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间） 目的：选取合适的反应时间）
加 液 程 序 表
管号 磷酸苯二钠 酶液 1 0.5 0.5 2 0.5 0.5 3 0.5 0.5 4 0.5 0.5 5 0.5 0.5 6 0.5 0.5 0 0.5
结果： 结果： 0 酚含量/µmol 酚含量 吸光度 0 1 0.04 2 0.08 3 0.12 4 0.16 5 6 7 0.28 8 0.32
0.20 0.24
以酚含量（ 为纵坐标， 以酚含量（µmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线 ）为横坐标， 为纵坐标 绘制标准曲线。
• 4、[S]与V0关系实验 [S]与
6 0.6 0.4 2 0.5
7 0.7 0.3 2 0.5
8 0.8 0.2 2 0.5
0.5 0.5
35℃保温10分钟 ℃保温 分钟
号管作空白， 以0号管作空白，在可见光分光光度计 号管作空白 在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度 波长处读取各管的吸光度 （A680nm）。 ）。
结果： 结果：
0 反应时间 吸光度 0
1 3
2 5
3 10
4 15
5 20
6 25
以反应时间为横坐标， 为纵坐标， 以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反 为纵坐标 应进程曲线， 应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初 速率的时间范围。 速率的时间范围。
• 3、制作酚标准曲线 • （目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所相 目的：可从酚标准曲线上查出A nm所相 当的酚含量,并计算出反应速度（ 当的酚含量,并计算出反应速度（用每分钟 产物生成量来表示） 产物生成量来表示）
实验四 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定
上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于实 验。
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
管号
1
磷酸苯二钠
0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验四 酸性磷酸酶Km及 Vmax值测定
一、概述
酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
管号
1
磷酸苯二钠
0.5
酶液
0.5
精确反应时间 3
碳酸钠溶液 2
酶液
－
Folin－酚溶液 0.5
加液程序表
2
3
4
5
6
0
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过滤， 取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min，取上清。
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
实验四 酸性磷酸酶Km及 Vmax值测定
一、概述
酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
《酸性磷酸酶的》课件
研究进展：酸性磷酸 酶与其他生物标志物 的联合应用在肿瘤、 心血管疾病等研究中 的应用前景
联合检测方法：介绍酸 性磷酸酶与其他生物标 志物的联合检测方法， 如酶联免疫吸附试验、 荧光定量PCR等
PART SEVEN
研究酸性磷酸酶的分子结构，了解其功能与作用机制 探索酸性磷酸酶在生物体内的分布与调控机制 研究酸性磷酸酶在疾病发生发展中的作用，为疾病治疗提供新思路 开发酸性磷酸酶的抑制剂或激活剂，为药物研发提供新方向
代谢
酸性磷酸酶B 主要存在于细 胞核中，参与 DNA修复和基
因表达调控
酸性磷酸酶A 和酸性磷酸酶 B在生理功能 和调控机制上
有所不同
PART THREE
细胞内：主要存在于细胞质中，参 与细胞代谢
组织分布：主要分布在肝脏、肾脏、 骨骼等组织中
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
细胞外：存在于细胞外液中，参与 细胞间信号传递
酸性磷酸酶的检测：通过检测酸性磷酸酶的活性，可以评估骨质疏松症的严重程度
酸性磷酸酶在骨关节炎中的作用：参与骨关节软骨代谢，影响关节健康 骨关节炎的症状：关节疼痛、肿胀、僵硬等 酸性磷酸酶与骨关节炎的关系：酸性磷酸酶水平升高可能与骨关节炎的发生和发展有关 治疗方法：药物治疗、物理治疗、手术治疗等，其中药物治疗包括抑制酸性磷酸酶活性的药物
酸性磷酸酶在骨 代谢中的调节作 用：通过调节骨 细胞活性和骨基 质代谢，维持骨 代谢的平衡
酸性磷酸酶在骨 代谢中的其他作 用：参与骨细胞 凋亡和骨细胞信 号传导，影响骨 代谢的调控
酸性磷酸酶在免疫反应中的作用：参与免疫细胞的激活和增殖，增强免疫反应 酸性磷酸酶在炎症反应中的作用：参与炎症介质的生成和释放，促进炎症反应 酸性磷酸酶在免疫调节中的作用：参与免疫调节，维持免疫系统的平衡 酸性磷酸酶在炎症调节中的作用：参与炎症调节，减轻炎症反应对机体的损害
实验九：酸性磷酸酯酶米氏常数、最大反应速度测定
07:04:46
结果与计算
4
HHU Hunan PRC | 吴黎明
1、通过A680求出对应的酚标准液体积（V,mL），则产物的 浓度[P]=0.5×V（mmol/L）； 2、各底浓度下的反应速率v=0.5×V÷10（mmol/L/min）； 3、以1/v为纵坐标，1/[S]为横坐标作图，得到双倒数方程 ，根据方程求出Km和vmax。
A680
以A680为纵坐标，酚标准应用液体积（mL）为横坐标作标准曲线
07:04:46
实验步骤
3
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3、测定Km、Vmax 取试管7支，0～6编号，空白管为0号。各管按下表加入不 同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2M pH5.6乙 酸盐缓冲液至0.5mL。35℃预热2min后，逐管记时加入酸性
1～5号管分别加入0.1-1.0mL酚标准应用液，并用蒸馏水将 各管体积补充至1.0mL，0号管中加入1.0mL蒸馏水。 各管各加1mol/L碳酸钠溶液5.0mL和Folin-酚稀溶液0.5mL ，摇匀后，35℃保温显色10分钟。
以0号管作空白，在可见光分光光度计680nm波长处读取各
管的吸光度A680。
实验原理
2
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在温度、pH及酶浓度恒定的条件下，底物浓度对酶促反应
的速度有很大的影响。在底物浓度很低时，酶促反应的速度（ v）随底物浓度的增加而迅速增加； 随着底物浓度的继续增加，反应速度的增加开始减慢；当 底物浓度增加到某种程度时，反应速度达到一个极限值（Vmax ）。
6 2.5 0.4
0.5 2.0
注意事项
5
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实验巨噬细胞酸性磷酸酶显幻灯片
4．核酸显示法
显示DNA的传统方法为Feulgen反响。 切片DNA经弱酸(1mol/LHcl)水解,其
上的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键翻开, 使脱氧核糖的一端形成游离的醛基,这 些醛基在原位与Schiff试剂(无色品红 亚硫酸钠溶液)反响,形成紫红色的化 合物,使细胞内含有DNA的部位呈紫 红色阳性反响.紫红色的产生,是由于 反响产物的分子内含有醌基,醌基是发 色团,因此具有颜色. 如用甲基绿-派假设宁反响，可同时 显示细胞内的DNA和RNA。 甲基绿与细胞核中的DNA结合呈蓝 绿色，派假设宁与核仁及胞质内的 RNA结合呈红色。
附：0．2mol／L醋酸缓冲液〔pH4．6〕配制方法
0.2mol/l醋酸〔ml〕 25.5
0.2mol/l醋酸钠〔ml〕24.5
4、1％硫化铵溶液 硫化胺 1ml 蒸馏水 9ml5、姬姆萨染液〔 Nhomakorabea：30〕
姬姆萨原液
3滴
磷酸盐缓冲液〔pH6．8〕 5ml
实验方法
1、巨噬细胞诱导：实验前2天开场，每日向小鼠腹腔注射6 ％淀粉肉汤1ml，连续注射3天。
作业
1、比较对照标本与正常处理标本结果的不同 2、比较吞噬活性强的大体积巨噬细胞和吞噬活
性弱的小体积巨噬细胞酸性磷酸酶的分布与活 性
酶的显示法是通过显示酶的活性来说明酶的存 在，而不是酶的本身。
将具有酶活性的组织放人含有一定底物的溶液 中孵育，底物经酶的作用形成初级反响产物， 它再与某种捕捉剂相反响，形成显微镜下可视 性沉淀，即最终反响产物。
3．脂类显示
脂类物质包括脂肪与类 脂。
标本可用甲醛固定、冷 冻切片、用油红、苏丹 Ⅲ、苏丹Ⅵ、苏丹黑B、 尼罗蓝等脂溶性染料染 色；亦可用锇酸固定兼 染色，脂类呈黑色。
酚标准曲线
105177216 缪心豹实验项目名称酸性磷酸酶Km和Vmax值测定同组实验者陈伦，林海，蒋煜，缪心豹实验地点王长来楼试验时间2011/9/28指导教师成绩一、目的和要求1．掌握酶反应动力学米曼式方程及其各参数意义。
2．掌握利用双倒数作图求解Km和Vmax值。
二、基本原理利用磷酸苯二钠作为反应底物，酸性磷酸酶催化反应，水解生成苯酚和无机磷酸盐。
通过检测生成的产物苯酚的量可间接计算反应初速度，然后根据不同底物浓度和反应初速率的倒数作图求解Km和Vmax值。
三、试剂与器材试剂：0.2ml/L,PH=5.6醋酸缓冲液酸性磷酸酶溶液100mmol/L磷酸苯二钠溶液5mmol磷酸苯二钠溶液1mol/L碳酸钠溶液Folin-酚试剂酚标准液器材：酸性磷酸酶原溶液恒温水浴槽可见分光光度计四、操作步骤测定酶的KM值及Vmax值（1）.取试管7支，按1~6编号，另设0号管为空白管（2）.按4-5表加入不同体积5mmol/L磷酸苯二钠溶液，并分别补充0.2mol/L,PH=5.6醋酸缓冲液至各管体积达0.5ml（3）.35摄氏度预热2分钟后，按序逐管加入酸性磷酸酶溶液0.5ml,立即摇匀，每管精确计时，继续保温15分钟。
（4）.反应时间到达后，立即逐管加入1mol/L碳酸钠溶液2ml，摇匀，再加入Folin-酚稀溶液0.5ml（5）.0号管最后加入酶液0.5ml（6）.各管冷却后，以0号管做空白，用可见分光光度计在680nm波长处读取各管的吸光度（7）.从酚标准曲线上查出各管吸光度所相当的酚含量，进而计算各种底物浓度下的反应初速率（8）.以1/ [S]为横坐标，1/V。
为纵坐标作图，求得Km值和Vmax值六、数据记录。
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定26页PPT
可逆性抑 制作用
抑制剂通常以非 共价键与酶或酶 -底物复合物可 逆性结合，使酶 活性降低或消失 。
可逆性抑制作用
竞竞争争性 性
Km增大
非非争性竞竞性争
Vmax降低
反反竞竞争 争性 性
Km, Vmax降低
底物浓度对酶促反应速度的影响
低
反应速度和底物浓 度成正比关系
反应速度增幅下降
高
底物浓度
的增高
酶活性中心被底物饱和
米氏常数的求法
1
V
=
Km Vmax
×
1 [S]
+
1
Vmax
V表示酶促反应速度 Vmax表示酶促反应最大速度
[S]表示底物浓度
Km表示米氏常数
双倒数作图法
底物浓度对酶活性 的影响
——碱性磷酸酶Km个相当重要的 常数，通过实验，可理解并掌握利用实验求出 Km的方法。
实验原理
磷酸苯二钠
H2O
碱性磷酸酶
酚 Na2HPO4
pH=10.0，
37℃ OH－（磷酚钼试钨剂酸）
650nm 蓝色化合物
吸光度表示不同底物浓度时的酶反应速度。以吸 光度的倒数作纵坐标，以底物浓度的倒数作横坐 标，按Lineweaver-Burk作图法求出Km值。
试剂
1．酚试剂 2．2.5mmol／L磷酸苯二钠基质液 3．碱性缓冲液(pH-10.0) 4．碱性磷酸酶液
混匀后，37℃水浴15min，以第8管调节零点，
在650nm波长处进行比色，读取各管A值。
处理结果
管号 1 2 3 4 5 6 7
A650
1/A650 [S]
1/[S]
以1/A650对1/[s]按Lineweaver-Burk作图法作
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测定26页PPT
那里就 没有自 由。— —洛克
•
30、风俗可以造就法律，也可以废除 法律。 ——塞·约翰逊
定
16、业余生活要有意义，不要越轨。——华盛顿 17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。——罗素·贝克 18、最大的挑战和突破在于用人，而用人最大的突破在于信任人。——马云 19、自己活着，就是为了使别人过得更美好。——雷锋 20、要掌握书，莫被书掌握；要为生而读，莫为读而生。——布尔沃
END
酶促反应动力学 碱性磷酸酶Km值测
•
26、我们像鹰一样，生来就是自由的 ，但是 为了生 存，我 们不得 不为自 己编织 一个笼 子，然 后把自 己关在 里面。 ——博 莱索
•
27、法律如果不讲道理，即使延续时 间再长 ，也还 是没有 制约力 的。— —爱·科 克
•
28、好法律是由坏风俗创造出来的。 ——马 克罗维 乌斯
实验十五：酸性磷酸酶的显示课件
• 4．染色的方法: （1）利用化学原理进行的染色方法: 金属沉淀法 : 利用酶催化反应形成的分解产物与金属化合物反应，最终生成 有色沉淀，借此辨认所要检查的酶的活性。偶氮偶联法: 用人工 合成的酶底物在酶的作用下产生分解产物，后者与重氮盐结合形
成不溶性的偶氮色素。Schiff反应法: 游离的醛基可使Schiff试剂 中的无色红变为紫红色产物，这种反应通常用于显示多糖类（
，用标记抗体显示相应抗原。
• 5．酸性磷酸酶的显示方法: 酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）主要存在于巨噬细胞，定 位于溶酶体内。在溶酶体膜稳定完整时，底物不 易渗入，ACP活力微弱或无活性，经固定，在合 适pH条件下，膜本身变为不稳定，逐渐改变其渗 透性，底物可以渗入，酶活力被显示。ACP在酸 性条件下（pH4.7）可使作用液中的底物β-甘油磷 酸钠的磷酸根解离出来，进而与溶液中硝酸铅结 合形成磷酸铅沉淀，因其是难溶解的无色沉淀物 ，需要与黄色的硫化铵作用，生成棕黑色PbS沉 淀而被显示出来。
• 3．染色的作用: 由于正常的生物组织是无色透明的，因此无法在 光镜下进行观察。因此必须要对样品进行染色；染色剂可以渗透 到组织的间隙中，细胞中的蛋白质等成份可以吸附不同的色素粒 子；染色剂中的阳离子和阴离子可分别与细胞中的酸性、碱性物 质相结合。染色就是根据这些原理，利用染色剂与细胞内含物的 物理作用与化学作用，将细胞和组织染成各种不同的颜色；由于 染色剂的化学性质不同，以及固定材料时所用的固定剂不同，染 色剂对被染色的组织有一定的选择性，从而使某些部位染色很清 楚，而另一些部位可能完全不着色。例如，有些染色剂可染细胞 核，有些染色剂可染细胞质。
在荧光显微镜下对这些成分进行直接观察。放射自显影技术: 用 放射性核素标记化合物，使其在细胞中参与代谢，将带有标记的 代谢产物通过放射自显影技术显示出来，借以探测物质代谢途径
酶活性的测定PPT课件
（1）样品对照：只加样品不加底物 （2）底物对照：不加样品只加底物 （3）时间对照：含有酶和底物但反应时间为零的对
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
11
酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
5
6
米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
照管；也可以先用蛋白沉淀剂或其他试剂停止反 应后，再加底物予以抵销。
11
酶的区域化分布
表7-3 诊断常用血清酶的来源
血清酶
符号
鸟氨酸氨基甲酰转移酶
OCT
卵磷脂胆固醇酰基转移酶 LCAT
谷氨酸脱氢酶
GLDHΒιβλιοθήκη 山梨醇脱氢酶SDH
丙氨酸氨基转移酶
ALT
异柠檬酸脱氢酶
ICD
-谷氨酰转肽酶
-GT
5ˊ-核苷酸酶
5ˊ-NT
单胺氧化酶
MAO
天门冬氨酸氨基转移酶
AST
肌酸激酶
CK
乳酸脱氢酶
LDH
碱性磷酸酶
ALP
酸性磷酸酶
ACP
淀粉酶
AMS
脂肪酶
LPS
来源
肝 肝 肝 肝 肝、肾、心 肝、胎盘、心 肝、胆、肾、小肠 肝、胆道 肝、肾、脑 心、肝、骨骼肌 骨骼肌、心、脑 心、肾、骨骼肌、肝、肺 小肠、胎盘、肝、肾 前列腺、红细胞、血小板 胰、唾液腺
5
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米-曼氏方程：
Vmax〔S〕 v = —————
〔S〕+ Km
上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度， 〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。
7
由米-曼氏方程可以导出：
（Vmax-v）〔S〕 Km = ———————
v
当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。
应加入不抑制该酶活性的防腐剂并冰箱保存，以 防止底物被分解或变质 • 4、在测定过程中所用器材应绝对清洁，不应含有 酶的抑制物 • 5、使酶活性测定在线性期内进行
酸性磷酸酶的.pptx
注意：显色过程中两种缓冲液： 柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供ACP反应条件 碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条件
第11页/共25页
3.各上清液中ACP比活性分析
ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；
比活性=
酶活性 U/ml 蛋白质含量mg/ml
目的要 求
1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因
素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
第2页/共25页
试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线
第4页/共25页
一、 ACP的分离纯化
1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广
第5页/共25页
2. ACP的分离纯化方法 ♥ 根据ACP的理化性质，可以用层析、电
泳、透析等多种方法分离纯化。
♥本实验采用分级离心+分段盐析法：
感谢您的观看！
第25页/共25页
心
缓慢搅拌
上清液 I
1mol/L MnCl2
4000rpm，10min离心
2ml/100ml上清液 I
（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）
上清液 II
第7页/共25页
上清液 II
饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II
4000rpm，8min离心
（溶解ACP， 沉淀杂 蛋白）
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3.各上清液中ACP比活性分析
ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即nmol/min·ml为1个活性单位；
比活性=
酶活性 U/ml 蛋白质含量mg/ml
目的要 求
1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 掌握酶的分离纯化方法； 3. 掌握酸性磷酸酶（aicd phosphatase ACP）活性测定的原理、方法和影响因
素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。
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试剂与器材
一、ACP的分离纯化试剂：见实验 教材P31； 二、ACP动力学分析试剂：见实验 教材P35；
线 5.抑制剂-速度（[I]-V）曲线
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一、 ACP的分离纯化
1.概况： ACP分布广泛 分子量100kD 最适pH5.0 热稳定性较好 溶解度较高 临床应用广
第5页/共25页
2. ACP的分离纯化方法 ♥ 根据ACP的理化性质，可以用层析、电
泳、透析等多种方法分离纯化。
♥本实验采用分级离心+分段盐析法：
感谢您的观看！
第25页/共25页
心
缓慢搅拌
上清液 I
1mol/L MnCl2
4000rpm，10min离心
2ml/100ml上清液 I
（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）
上清液 II
第7页/共25页
上清液 II
饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液 II
4000rpm，8min离心
（溶解ACP， 沉淀杂 蛋白）
实验四酸性磷酸酶Km及Vmax值测定ppt课件
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过 滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min， 取上清。
碳酸钠溶液
2 2 2 2 222
Folin－酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
酶液
－ － － － － － 0.5
35℃保温10分钟
测680nm处吸光度
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
H
17
实验中需注意事项： 酶反应作用时间精确控制
实验结果
Tube number
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于 实验。
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
加液程序表
管号
1234560
磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
酶液
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
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根据双倒数法计算出Km及Vmax
3
4
Vmax [S] V=
Km + [S]
5
三、实验步骤：
• 1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 • 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • 3、制作酚标准曲线 • 4、[S]与V0关系实验 • 5、双倒数作图法计算Vmax和Km
6
blank
buffer substrate enzyme
酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 清洗试管24支
1
一、概述 酸性磷酸酶：
催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。
是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测指 标。
2
二、实验原理
磷酸苯二钠
酶液
苯酚 ＋ 磷酸氢二钠
folin-酚测定酚的浓度
计算出反应速度（用产物生成量/min来表示）
酶液
－ － － － － － 0.5
Folin－酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
35℃保温10分钟
Folin－酚溶液已稀释好！
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
11
结果：
反应时间 吸光度
01 2 3 4 5 6 0 3 5 10 15 20 25
15
• 4、[S]与V0关系实验
16
实验加液程序表
管号
1234560
磷酸苯二钠 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.50 0.50
醋酸缓冲液 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 - -
酶液
0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 -
精 确 反 应 15 分 钟 35度
35℃保温10分钟
14
以0号管作空白，在可见光分光光度计680 nm波长处读取各管的吸光度 （A680nm）。
结果：
酚含量/μmol 吸光度
01 2 3 4 5 6 7 8
0
0.0 0.0 0.1 0.1 0.2 0.2 0.2 0.3 4 8 2 6 04 8 2
以酚含量（μmol）为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制标准曲线。
以反应时间为横坐标，A680nm为纵坐标，绘制反 应进程曲线，并从该曲线上求出酸性磷酸酶反应初
速率的时间范围。
12
• 3、制作酚标准曲线 • （目的：可从酚标准曲线上查出A680nm所
相当的酚含量,并计算出反应速度（用每分 钟产物生成量来表示）
13
0.4mM phenol standard solution H2O 1M Na2CO3
Certain Time
Stop the reaction
Color developed
7
• 生化实验课老师：于晓虹 • 实验报告请交到讲台上来 • 酶液稀释 取上清液３００微升，稀释
３０倍，用大试管装
• 科代表 李博恒
8
1、磷酸酶原液的制备：
称取5g绿豆芽茎（去头去根），加入pH5.6的 HAC缓冲液2ml研磨成浆并静置30分钟。纱布过 滤，取1.8ml滤液,以6000rpm，离心20min， 取上清。 上清液用pH 5.6的HAC缓冲液稀释30倍，用于 实验。
19
Folin-phenol reagent
加液程序表
01 2 3 4 5 6 7 8 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 22 2 2 2 2 2 2 2 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
9
• 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 • （目的：选取合适的反应时间）
10
加液程序表
管号
1234560
磷酸苯二钠 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
酶液
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
精确反应时间 3 5 10 15 20 25
碳酸钠溶液 2 2 2 2 2 2 2
Tube number
1
2
3
4
5
6
[S] (mM)
0.5
0.75
1
1.25
1.5
2.5
1/[S]
A680
phenolin)
1/ V0
1、酚含量从酚标准曲线上查得 2、V0 反应初速率（μmol/min）为酚含量除以酶反应时间（15分钟）。 3、双倒数作图法计算Vmax和Km
碳酸钠溶液
2 2 2 2 222
Folin－酚溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
酶液
－ － － － － － 0.5
35℃保温10分钟
测680nm处吸光度
注： 进行酶促反应时，注意预热，使所有的反应在同等条件下开始
17
实验中需注意事项： 酶反应作用时间精确控制
18
实验结果