牛奶抗生素残留检测方法研究进展

牛奶抗生素残留检测方法研究进展摘要近年来，不断出现的食品安全问题引起了人们的重视，凸显了食品安全方面存在的一些漏洞。牛奶作为一种营养丰富、价格低廉的食品，其安全问题几乎牵涉到每一个人，而抗生素残留问题是牛奶安全问题中比较严重的一个。如何快速准确地检测牛奶中是否存在抗生素残留很重要。主要综述了检测牛奶中抗生素残留的不同方法及各自的特点。

关键词牛奶；抗生素残留；检测方法

中图分类号 r155.5 文献标识码 a 文章编号 1007-5739（2013）05-0300-03

近年来，出现的一系列牛奶安全问题，严重打击了消费者对奶制品的信心。牛奶中抗生素残留则是奶制品安全问题中较为突出的一个，已成为公众关注的焦点[1]。世界粮农组织（fao）、世界卫生组织（who）的食品法、欧盟（eu）和美国食品与药品管理局（fdo）等对牛奶中抗生素残留量都有明确严格的规定，严禁抗生素残留量超标的牛奶上市[2]。在奶牛饲养中，如果不遵守规定的休药期、不合理用药、使用违禁药物等会导致牛奶中抗生素残留超标[3]。乳中抗生素残留主要存在2个方面的潜在危害：一是干扰人体正常菌群，引起细菌耐药性，导致部分人产生过敏反应；二是原料乳中的抗生素残留势必会对乳制品加工生产产生干扰，造成原料乳的浪费，致使企业效益蒙受损失[4]。目前监测牛奶中抗生素残留的方

法主要有4大类[5]：即微生物检测法、酶联免疫法、理化检测法和免疫传感器法。每种方法依据的原理不同，适用范围、操作要求、灵敏度也不尽相同。本文综述了4类主要的检测方法，分析了它们的优点及局限性。

1 检测方法

1.1 微生物检测法

微生物检测法是较为广泛应用的最经典方法，测定原理是根据抗生素对微生物生理机能、代谢的抑制作用来定性确定样品中抗微生物药物残留[6]。其优点是操作简单、可靠、费用低、无需高级实验设备，一般实验室及养殖场都能使用。因为牵涉到微生物的培养，所以检测时间相对较长，不能实现定量检测，不能满足某些抗生素最低限的检测。微生物检测法主要包括纸片法、ttc 法、管蝶法、试剂盒法等[7]。

试剂盒为抗生素残留的检测提供了更为便捷高效的手段。试剂盒一般是一种微孔板，每个微孔中包含营养琼脂培养基、对抗生素敏感的菌株、ph值指示剂。其原理为：微孔板在65 ℃温浴时，孢子受热萌发生长繁殖产酸，使培养基的ph值降低，培养基的颜色由紫色变为草绿色或黄色。如果牛奶中含有高于检测线的抗生素，微生物孢子萌发受到抑制，则不产酸，培养基保持原来的颜色。用肉眼观察颜色变化即可判断抗生素残留情况[8]。

对该类常用的试剂盒的研究报道较多，comunian et al[9]对

delvotest accelerator试剂盒进行评估，低于欧盟最大残留量浓度的青霉素g和磺胺嘧啶很容易检测出来，假阳性率低至95%，但对四环素和庆大霉素的检测能力则较弱。检测有时会出现假阳性的结果，这与牛乳本身成分复杂及外部环境影响有关。牛乳ph值、牛乳是否热处理、乳中大肠杆菌量、成品乳中防腐剂杀菌剂以及检测者经验等都会不同程度地使检测结果呈假阳性。chung et al[10]用微生物方法和hplc检测牛奶中磺胺类抗生素残留量试验，在269份奶样中21份为阳性，而hplc方法仅出现4份阳性。微生物检测法阳性率偏高，往往要配合其他方法一起对牛奶进行评估。它虽然具有一定的局限性，但因其方便快捷、不需要大型仪器和专业操作人员即可完成，为广大奶农所接受。

1.2 酶联免疫法

酶联免疫法（elisa）的特点在于敏感性高、特异性强、重复性好、处理量大。因其操作简便、结果判断较客观等因素，已广泛应用于免疫学检验的各领域中。elisa的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记，主要以竞争elisa为主。

国外学者用合成的强力霉素半抗原，有对-氨基苯甲酸（paba）臂，通过重氮偶合反应和混合酸酐的方法连接到牛血清白蛋白（bsa）或卵清蛋白（ova）。酶联免疫吸附试验（elisa）中，

dox-paba-ova偶联物作为包被抗原，而dox-paba-bsa用作免疫原，以产生多克隆抗体。优化主要参数后，得出检测限为1.96 μg/kg。

交叉反应（cr）较弱，与其他抗生素的交叉反应均低于0.1%[11]。

国占宝等[12]采用杂交瘤技术，制备抗四环素单克隆抗体。检测灵敏度较高，检测限较低；平均批内和批间变异系数均小于15%；四环素与金霉素等同类抗生素的交叉反应率大于 60%，与其他类抗生素无交叉反应。

张慧丽等[13]根据恩诺沙星与标记有碱性磷酸酶的恩诺沙星同时与限量的特异性固相恩诺沙星抗体进行竞争结合反应，通过分离未结合的标记抗原，测定标记抗原与抗体复合物化学发光强度，经相应的数学函数计算出待测抗原的含量的原理，利用金刚烷类体系作为化学发光底物，快速地测定牛奶中恩诺沙星残留量。检出限可达239.9 pg/ml，检测范围为350～1 000 pg/ml，批内与批间相对标准偏差均小于15%。

wang s et al [14]首先建立提取新霉素简便有效的方法，回收率为75%～105%，再用elisa法来检测新霉素残留量。高效液相色谱法验证elisa法的有效性，结果显示了良好的相关性，r2大于0.9。

用于检测牛奶中抗生素残留的酶联免疫法利用抗原抗体的特异性反应，故灵敏度较高[15]。但是一种方法只能检测一种或一大类抗生素，检测范围较小。酶联免疫法的关键在于制备特异性强且高效的抗体，重点在于半抗原的设计与合成、与载体蛋白的连接、抗体的制备，费用一般较高。

1.3 理化检测法

理化检测法是依据抗生素分子具有的性质，借助实验仪器对其分离检测的一种方法。分离应用的实验技术包括色谱和电泳等，检测应用的实验技术包括紫外、荧光、质谱、化学发光等。由于分离效率高、检测灵敏、结果稳定、重复性好、精确可靠，理化检测法是一种检测抗生素残留的精确方法。

tang q et al [16]用高效液相色谱法与串联质谱联用来同时测定牛奶中诺氟沙星、环丙沙星、氧氟沙星、恩诺沙星、芦氟沙星5种氟喹诺酮类药物残留。可以检测诺氟沙星含量为0.5 ng/g的牛奶，远低于国内规定的100 ng/g的最大残留限量（mrl）。

张尹等[17]采用乙腈沉淀蛋白，磷酸盐缓冲溶液为提取液，采用超声辅助萃取，固相萃取小柱净化，通过高效液相色谱进行分析检测，完全适用于牛奶中 9种β-内酰胺类抗生素残留量检测。利用超声辅助萃取，增强溶剂的穿透力，加速目标成分进入溶剂，促进萃取的进行，极大地提高了抗生素的萃取率[18]。

田春秋等[19]利用高效毛细管电泳（hpce）同时检测牛奶中青霉素类抗生素中间体6-氨基青霉烷酸（6-apa）以及3种青霉素类药物的方法。在采用40 mmol/l磷酸二氢钾、20 mmol/l硼酸缓冲体系（ph值7.8）、分离电压为28 kv、分离温度为30 ℃的电泳条件下，4.5 min 内可以实现对4种青霉素类药物的快速分离检测。wang l et al[20]利用微流控芯片电泳激光诱导荧光检测牛奶样品