定点突变

周赞虎等人采用快速PCR定点突变方法成功地对 hCu,Zn-SOD进行了基因改良，即将hCu,Zn-SOD 基因中非活性中心的Cys111密码子突变为Ala密码 子，以提高其稳定性。 朱大兴等人对该试剂盒试验规程进行了改良， 利用实验室的常规试剂进行定点突变，并指出PCR 突变反应产物能被琼脂糖电泳检测到是非常重要的， 因为这样有利于分析试验成败的原因。 周兴等人以定点突变方法对325RLDRD32基序 的带电荷氨基酸进行突变，并构建R325D、R328A、 R328D、R328Q和D329N五个突变体。
1988年，ein首次将其用于植物转基因研究，克服了当时农杆菌 介导的转基因方法的受体种类和基因型的限制，开创了植物转基 因方法的新领域。McCabeetal利用基因枪法转化大豆幼胚和成 熟胚的下胚轴获得了转基因再生植株。 1990年，From示etal利用基因枪法成功转化T玉米胚性愈伤组织 。同年Fine:andMcmullen(1990)用陆地棉柯字310的胚性悬浮系 进行的基因枪转化。获得了10个再生植株，较农杆菌介导的遗传 转化，所用的再生时间较短(5个月)。其后，MeCabeandM inell 报道T基因型独立的基因枪转化方法。 1994年，Hieital通过使用农杆菌侵染诱导剂乙酞丁香酮(AS)以及 构建巧rG和巧rB高效表达的超双元载体，高效成功地转化了水稻 。利用该转基因系统，Ishidaetal(1996)、Tingayetal(1997)和 Chengetal(1997)相继获得了玉米、大麦和小麦的转基因植株。
八、参考文献
1.定点突变技术的研究进展
2.植物基因定点突变与定点置换技术及其在植物遗传改良中的应用
3，基因定点突变技术简介
谢谢观赏
七、应用前景
• 不同于定点突变的是基于PCR的随机突变，通过改 变PCR条件提高PCR过程中的随机出错，这种方法 适用于未知的蛋白质，作全局性分析，所以有人称 为饱和突变（saturation mutagenesis）。不过这种 方法由于没有目的性，分析操作相当繁琐，并且不 会出现一个位点2个以上碱基突变，因而应用上有 局限性。定点突变适用于蛋白结构已有初步了解的 基因，比PCR随机突变更有目的性，也更为精确， 简单，同时改造基因更加“随心所欲”。由于定点 突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛的应用前景 ，相信这个技术在不远的将来还会有更大的改进和 发展，也必将为更多人熟悉应用。
DpnI酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于 常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对DpnI 敏感而被切碎（DpnI识别序列为甲基化的GATC， GATC在几乎各种质粒中都会出现，而且不止一 次），而体外合成的带突变序列的质粒由于没有 甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成 功转化，即可得到突变质粒的克隆。这个试剂盒 非常巧妙的利用甲基化的模版质粒对DpnI敏感而 合成的突变质粒对DpnI酶切不敏感，利用酶切除 去模版质粒，得到突变质粒，使得操作简单有效。
孙卫国等人通过重叠P的核酸序列并克隆至原 核表达载体pBV220进行诱导、表达和纯化。 分别检测重组人角质细胞因子-2及其突变体 重组蛋白的生物活性和室温条件下的稳定性。
在分子生物学和基因工程中的应用
探明未知序列的结构和功能的关系，如启动子 诱变筛选，真 核的TATA盒保守序列确定。 载体构建：调控元件，强启动子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最 佳。
• 盒式突变：用一段人工合成具有突变序列的DNA片段 ，取代野生型基因中的相应序列。 • 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制位点 ，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指导的定位 诱变引入限制位点。
五、定点突变的方法改进
• 设计一对包含突变位点的引物（正、反向）， 和模版质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延 伸”，(所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延 伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反 复加热褪火延伸的循环，这个反应区别于滚环 扩增，不会形成多个串联拷贝。)正反向引物的 延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。
二、定点突变的目的
• 基因定点的突变是指按照设计的要求，使基因的特定 序列发生插入、删除、置换和重排等变异。 • 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间关系 的有力工具。 • 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定碱 基进行定点改变，缺失或者插入，可以改变对应的氨 基酸序列和蛋白质结构和功能，改造酶的不同活性或 者动力学特性。
六、定位突变用途
• 定点突变法的应用不仅广泛用于基因工程技术 领域，还可用于农业培育抗虫、抗病的良种， 用于医学矫正遗传病、治疗癌症等病。 • 定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究 蛋白质相互作用位点的结构、改造酶的不同活 性或者动力学特性，改造启动子或者DNA作 用元件，引入新的酶切位点，提高蛋白的抗原 性或者是稳定性、活性、研究蛋白的晶体结构 ，以及药物研发、基因治疗等等方面。
这个试剂盒的原理和Clontech的相似，就是准 备多个带突变的引物（同方向，对同一单链模 版），退火后全部突变引物（不超过5个）都 结合在同一环状单链模版，PfuTurbo聚合酶延 伸，碰到下一个引物就停止，各片断经连接成 环，和单链模版组成杂和环，DpnI消化双链模 版，也消化杂和环中的模版，只留下新合成的 带多个突变的单链环（mutant ssDNA），得 以转化E.coli，形成双链质粒。
（2）PCR介导的定点突变
• 在最初所建立的PCR方法中就可看出只要引物带有错 配碱基便可使PCR产物的末端引入突变。但是诱变部 分并不总在DNA的中间部分进行诱变。 • 目前采用重组PCR进行定位诱变，可以在DNA片段的 任意部位产生定位突变。
（3）盒式突变
• 1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式突变。
基因的定点突变
一、定点突变的发展史 二、定点突变的目的 三、定点突变的原理
目 录
四、体外定点突变的方法 五、定点突变的方法改进 六、定位突变用途 七、应株转基因植株(zambryski，1983)的获得 标志着植物转基因时代的到来。 1984年，Paszkowski将NP皿I等嵌合基因克隆到E.coh质粒上 ，并用PEG转化烟草获得成功。 1985年，Horsch等创立了农杆菌介导的叶盘法转基因系统， 大大简化了以往利用原生质体为受体的转基因体系，具有里程 碑的意义。 1987年，Frommetal转化CAT基因，获得成功。1987年， Jcffersontal利用GUS作为报告基因，使转基因愈伤组织和植 株检测变为方便快速，大大的提高转基因效率。1987年，美 国康耐尔大学的Sanford等发明了基因枪。
• 有的时候研究可能需要多个位点的定点突变 ，比如改造酶的活性或者动力学特性，研究 蛋白之间的相互作用位点等，单点突变不能 满足实验的需要，重复进行单点突变也非常 浪费时间。因而Stratagene公司又推出了 QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis kit。最多一次实验可以引入5个 定点突变。
• 资料表明，引入3个定点突变的效率为60%， 5个定点突变的效率为30%。得到的其他质粒 是带有较少定点突变的质粒，以引入3个定点 突变为例，就是有40% 左右的转化质粒是带 有1—2个不同定点突变的质粒（因为存在 1—2个引物结合模版延伸形成单链环的可能 ）。这样，一次实验可以得到不同数目突变 的质粒，对于研究蛋白质结构和功能的关系 也是有用的。
三、定点突变的原理
• 定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向 目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引 入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱 基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效 的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因 研究工作中一种非常有用的手段。
在蛋白质工程中的应用
降低毒性，如TNF 改变亚型和种的特异性，如IFN的23位AAG（赖氨 酸），AGG（精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123 位Try（酪）变甘/丝，使IFN种属特异性明显改变， 对人抗病毒活性小于牛。 提高活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提高蛋白质作用的专一性，如IFNβ的9-56位被 IFNa的7-54位取代后，活性提高40倍。
四、体外定点突变的方法
• （1）寡核苷酸介导的定点突变 • （2）PCR介导的定点突变 • （3）盒式突变
（1）寡核苷酸介导的定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱变技 术是由加拿大的生物化 学家( michael smith ) 发明的.
寡核苷酸定点突变基本原理
• 合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，使其与带有 目的基因完全互补。 • 合成的寡核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完 全互补。 • 然后用DNA聚合酶使寡核苷酸引物延伸，完成单链 DNA的复制。 • 由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一 条为突变型子代链。 • 将获得的双联分子通过转导入宿主细胞，并筛选出突 变体其中基因已被定向修改
刘欣毅等人介绍一种新型的基因定点突 变的方法，该方法巧妙利用了基因序列中广 泛存在的不完整的平端酶切位点。与传统方 法相比可以迅速地在全基因的任何部位替换 核苷酸，并可以在突变试验过程中直接将目 的基因克隆到T载体上,便于测序及进一步克 隆。利用该方法成功的获得了 DdsA(decaprenyl diphosphate synthase,十 聚异戊二烯焦磷酸合成酶)在4个氨基酸位点 上的19个变体酶