分子生物学技术 课件

蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒， 在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电 场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术, 称为电泳。
根据支撑物的不同，可分为薄膜电泳、凝胶电泳 等。
•几种重要的蛋白质电泳：
➢ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，常用于蛋白质分子量 的测定。
➢ 等电聚焦电泳，通过蛋白质等电点的差异而分离 蛋白质的电泳方法。
印迹技术
一、Southern 印迹: 可用于分析基因拷贝数的变化
• 由E. M. Southern在1975年提出
• 可用于分析基因拷贝数的变化
• 基本操作过程包括
– 待测DNA样品的制备和基因探针的标记；
– 待测DNA样品的电泳分离；
– 电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支 持物；
• 核酸分子杂交（Nucleic acid hybridization） • 聚合酶链式反应(PCR) • 单链构象多态性（SSCP） • 限制性片段长度多态性（RFLP） • DNA序列测定（DNA sequencing） • 生物芯片（biochips） • Western免疫印迹（Western blotting） • 免疫组织化学诊断
• 沉降系数(sedimentation coefficient, S)
蛋白质在离心场中的行为用沉降系数表示,沉 降系数与蛋白质的密度和形状相关 。
因为沉降系数S大体上与分子量成正比关系，故可 应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高 度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。
蛋白质的分子量和沉降系数
2. Structure of dCTP
3. Base Tautomerism
3. Chargaff rules - A=T, G=C
helical
10 layer Lines Between Cross Patterns (10 Residues Per turn)
1A
（三）根据氨基酸序列： 预测蛋白质三维空间结构
68500
4. 60
过氧化氢酶（马肝） 247500
11. 30
脲酶（刀豆）
482700
18. 60
纤维蛋白原
339700
7. 60
六、用化学或反向遗传学方法：
可分析或演绎多肽链的氨基酸序列
分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成（离子交换层析）
测定多肽链的氨基末端与羧基末端为何种氨基酸残基
把肽链水解成片段，分别进行分析
或者多肽(分子诊断）。
诊断依据(遗传物质改变)
DNA、RNA或蛋白质水平变化。如病毒基因及其转
录产物在体内从无到有、癌基因表达水平从低到高；
基因结构变化。如点突变引起基因失活、染色体转
位引起基因异常激活或灭活。
基因诊断的特点
✓ 高特异性 ✓ 高灵敏性 ✓ 早期诊断性 ✓ 应用广泛性
基因诊断中常用的分子生物学技术
Isolation, Purification, Identification and Structural Analysis of Proteins
一、丙酮沉淀、盐析及免疫沉淀: 是常用的蛋白质沉淀方法
使用丙酮沉淀时，必须在0～4℃低温下进行， 丙酮用量一般10倍于蛋白质溶液体积。蛋白质被丙 酮沉淀后，应立即分离。
– 可用于基因诊断
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分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization)
在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放 在 同 一 溶 液 中 ， 或 把 DNA 与 RNA 放 在 一 起 ， 只 要 在 DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系， 就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex) 。
──────────────────────
蛋白质
分子量
S
──────────────────────
细胞色素C( 牛心)
13370
1. 17
肌红蛋白（马心）
16900
2. 04
糜蛋白酶原（牛胰） 23240
2. 54
β - 乳球蛋白（羊奶） 37100
2. 90
血红蛋白（人）
64500
4. 50
清白蛋白（人）
* 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的基
本原理，从理论上计算蛋白质分子的空间结构。
* 通过对已知空间结构的蛋白质进行分析，找出一级
结构与空间结构的关系，总结出规律，用于新的蛋 白质空间结构的预测。
第二讲
DNA操作的基本技术
The Basic Technologies for DNA Manipulations
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核酸印迹技术与分子杂交
Nucleic Acid Blotting and Molecular Hybridization
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什么是核酸分子杂交
• 核酸分子杂交（nucleotide molecular hybridization）
–以DNA的变性、复性为理论基础
–指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或 RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经 过复性处理后，形成异源双链的过程
➢ 双向凝胶电泳，蛋白质组学研究的重要技术。
蛋白质的二维电泳
二 维 电 泳 图
四、应用相分配或亲和原理： 可将蛋白质进行层析分离
•层析(chromatography)
待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固态物质 （固定相）时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、 电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相 中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋 白质的目的 。
除了丙酮以外，也可用乙醇沉淀。
• 盐析(salt precipitation) 是将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，
使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致 蛋白质沉淀。
水化膜
+++
酸
+
+碱
++
带正电荷的蛋白质 在等电点的蛋白质
碱
－－
－
－
酸
－ －－
－
带负电荷的蛋白质
脱水作用
脱水作用
脱水作用
羧肽酶A法 羧肽酶B法 羧肽酶C法
•通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列：
分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列
排列出mRNA序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列
七、应用物理学、生物信息学原理：
可进行蛋白质空间结构测定或预测
（一）圆二色光谱可估算蛋白质二级结构比例
通常采用圆二色光谱(circular dichroism，CD)测定 溶液状态下的蛋白质二级结构含量。 -螺旋的CD峰有 222nm处的负峰、208nm处的负峰和198nm处的正峰3个 成分；而-折叠的CD谱不很固定。
基因组、转录组、蛋白质组、代谢组之间的关系
基因组学是基础、 转录组学是信息、 蛋白质组学是功能、 代谢组学是结果。
整合也是创新
• 方法的结合 • 形态与机能研究的结合 • 中西医的结合
21世纪分子医学发展的主要领域
• 分子诊断 • 基因治疗 • 生物工程药物
第一讲
蛋白质的分离、纯化、鉴定 和结构分析
基因诊断中常用的分子生物学方法比较
方法
优点与问题
解决方案
核酸分子杂交 结果可靠但操作繁琐
选择合适的探针
PCR
灵敏度、特异性高
设计合适的引物
SSCP操作Βιβλιοθήκη 便、检出率不高选择合适的片段
RFLP
结果可靠但限制较多
选择合适的限制酶
DNA测序
可自动化，但不适宜广泛使用 与PCR配合使用
生物芯片
效率高，成本高，不适宜广泛 选择合适的芯片 使用
是基因诊断的常用技术
基因诊断之父—简悦威
1976年加州大学华裔科学家 Kan YW 用核酸分子杂交技术首次对一例α地中海贫 血进行诊断。
基因诊断的概念、特点及临床意义
定义：
利用分子生物学技术，通过检测基因及基因表达 产物的存在状态，对人体疾病作出诊断的方法。基因 诊断检测的目标分子是DNA、RNA，也可以是蛋白质
分子生物学常用实验技术
The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology
生物化学与分子生物学教研室
徐文弟
2010.9.23
现代分子生物学
• 遗传中心法则与组学
遗传信息传递的基本规律
• 分子生物学研究内容
– 特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交，放射自显影或
显色检测目的DNA的存在。
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Edwin Southern
Sir Edwin Southern (born 1938), US biologist and deviser of the DNA analytical technique Southern blotting. This technique uses enzymes to fragment DNA (deoxyribonucleic acid), and the fragments are then separated in an electrophoresis gel. The separated fragments are then "blotted" onto a nitrocellulose filter and marked with radioactive probes. The probes indicate the presence of specific genes (lengths of DNA that code for proteins). A sheet of photographic film is then laid over the filter. The radioactivity darkens the film, which reveals the position of genes in the DNA. This technique is widely used in genetic research. Photographed in the 1980s.