柑橘黄龙病LAMP快速检测方法的建立及应用_黄丽

Establishment and application of loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Citrus Huanglongbing
HUANG Li1，2， SU Hua-nan2， TANG Ke-zhi2*， HUANG Ai-jun2， ZHOU Chang-yong2， LI Zhong-an2
利用 CTAB 法提取柑橘叶脉基因组 DNA，提取 方法参照 Murray 等[16]方法，样品-20 ℃保存备用。 1.4 LAMP 引物的设计
根据 NCBI 公布的‘Ca. L. asiaticus’基因组的外 膜 蛋 白 基 因 保 守 序 列 （Genbank 登 录 号 ： AY842429），利 用 PrimerExplorer V4 在 线 软 件 （http: //primerexplorer.jp/e/ ） 在 种 属 特 异 保 守 区 域 设 计 外 引 物对（F3 和 B3）和内引物对（FIP 和 BIP）；引物由上 海捷瑞生物工程有限公司合成。 序列信息见表 1。 1.5 LAMP 反应体系和反应条件的优化
术，建立一种柑橘黄龙病的快速检测方法。
1 材料和方法
1.1 供试材料 从我国 7 省（市、区）收集黄龙病疑似样品，大部
分由中国农业科学院柑桔研究所国家苗木脱毒中心 田间调查采集， 少量样品由现代柑橘产业体系综合 试验站和各地植保植检系统工作人员提供， 所有样 品 4 ℃保存备用。 溃疡病、黑星病、炭疽病和褐斑病 等柑橘病害的 DNA 模板在国家苗木脱毒中心实验 室-20 ℃保存。 1.2 主要试剂
引物名称 Primer name omp-F3 omp-B3 omp-FIP(F1c-F2) omp-BIP(B1c-B2)
表 1 LAMP 引物及其序列
Table 1 Primers of LAMP and their sequences
Байду номын сангаас
引物长度 Primer length/bp 18 20 41 43
(1College of Horticulture and Landscape Architecture， Southwest University， Chongqing 400716 China； 2Citrus Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Chongqing 400712 China)
Abstract: 【Objective】The objective of the study is to develop a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Candidatus Liberibacter asiaticus. 【Method】The detection method is based on the loop -mediated isothermal amplification(LAMP) reaction. Outer membrane protein gene of HLB pathogen was amplified by a set of four special primers that recognize six distinct sequences of the target. The reaction conditions of the method were optimized. Amplification products were visualized by naked eyes either as turbidity or in the form of a color change when SYBR Green I， a fluorescent dsDNA intercalating dye， was employed. The specificity and sensitivity of the method was also evaluated. 【Result】The amplification can be finished in 70 minutes by incubating the mixed solution of all reagents in a single tube with Bst DNA polymerase at 63 ℃ . The electrophoresis results showed ladder -like bands from LAMP products of HLB-positive samples. The lowest detection limit of the LAMP and Real -time PCR method was 3.9 ×101 copies， 100 fold higher than conventional PCR. The HLB detection rate of LAMP for 105 field samples was 52.4% ， and that of the conventional PCR method was 37.1%. The coincidence rate of the two methods was 84.7%. 【Conclusion】The studies suggested that LAMP method was rapid， simple， specific and sensitive for the detection of HLB. The LAMP can be a new and alternative technique for rapid detection of citrus huanglongbing. Key words: Candidatus Liberibacter asiaticus； Outer membrane protein gene； LAMP
（1 西南大学园艺园林学院，重庆 400716； 2 中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）
摘 要：【目的】为了建立柑橘黄龙病菌亚洲种 LAMP 快速检测方法。 【方法】根据黄龙病菌亚洲种外膜蛋白基因，在 种属特异保守区域的 6 个位点设计 2 对特异性引物， 对反应 条 件 和 体 系 进 行 优 化 ， 并 通 过 产 物 沉 淀 观 察 和 SYBR Green I 荧光染料显色的方法来快速判读检测结果。 同时对田间样品进行了特异性和灵敏度分析试验。 【结果】该方法 仅需 63 ℃反应 70 min 即可得到结果，特异性强，灵敏度高。 对柑橘常见病害样品进行 LAMP 扩增，仅 HLB 阳性样品 扩增产物电泳呈特征性梯状条带。 检测灵敏度比常规 PCR 高 100 倍，与实时定量 PCR 相当。 在对 105 份黄龙病田间 疑似样品检测中，LAMP 阳性检出率为 52.4%，常规 PCR 为 37.1%，2 种检测方法符合率为 84.7%。 【结论】建立的黄龙 病菌亚洲种 LAMP 检测方法，快速简便、特异性强、灵敏度高，为快速检测柑橘黄龙病提供了新方法和新思路。 关键词： 柑橘黄龙病菌亚洲种； 外膜蛋白基因； 环介导等温扩增技术 中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009－9980(2012)06－1121－06
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.2012.06.006
果 树 学 报 2012，29（6）: 1121～1126 Journal of Fruit Science
柑橘黄龙病 LAMP 快速检测方法的建立及应用
黄 丽 1，2，苏华楠 2，唐科志 2*，黄爱军 2，周常勇 2，李中安 2
日本学者 Notomi 等[11]于 2000 年开发了 一 种 新 型的恒温核酸扩增方法， 即环介导等温扩增法 （Loop-mediated isothermal amplification， LAMP）。 该 技术针对靶基因的 6 个特定区域设计 4 条特异引 物， 借助具有链置换作用的 DNA 聚合酶 （Bst DNA polymerase），在等温条件下进行靶序列高效扩增。 它 避免了常规 PCR 温度循环的特殊要求， 因其简便、 高效，成本低、检测周期短等优点，具有较高的应用 价值。LAMP 检测技术已广泛应用于临床、食品、农业 等领域，目前在植物中主要集中在植物病毒、细菌、 真菌性病害及转基因作物的检验检疫工作中[12-15]，具 有较大的开拓空间。 因此， 我们主要运用 LAMP 技
1122
果树学报
29 卷
橘生产省（市、自治区）中已有 11 个受到该病危害， 严重制约柑橘产业的健康发展。 其病原物暂定为 α变形菌纲韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter），包 括 亚 洲 种 （‘Ca. L. asiaticus’）、 非 洲 种 （‘Ca. L. africanus’） 和 美 洲 种 （‘Ca. L. americanus’） ， [1-2] 在 我 国该病害主要由亚洲种引起[3]。 田间症状表现为 病 树的黄梢和叶片的斑驳型黄化，果实小，畸形，严重 影响柑橘的品质与产量。 由于目前缺乏有效药剂和 抗病品种，主要采取砍除病树、防治木虱和种植无 病苗木等防控措施，因此加强柑橘黄龙病的早期诊 断显得尤为重要。 传统的指示植物[4]、电镜[5]和血清 学[6]等 诊 断 方 法 不 仅 费 时 费 力 ，而 且 效 率 低 ；近 年 ， 常 规 PCR[7]、巢 式 PCR [8]和 实 时 定 量 PCR[9-10]已 应 用 到柑橘黄龙病的检测上，但是 PCR 检测技术需要特 殊仪器设备且检测成本较高， 不适合在田间大规模 快速应用，因此，在加强柑橘苗木检疫监测中，迫切 需要一种成本低廉、操作简便、结果判断快速、灵敏 度高和特异性强的柑橘黄龙病检测方法。
Bst DNA 聚合酶购自北京纽英伦生物技术有限 公司；氯化钾、硫酸铵和硫酸镁等购自 Sigma 公司； 10000×SYBR Green I 购自北京鼎国昌盛生物技术有 限责任公司；Trans1-T1 Phage Resistant 化学感受态 购自北京全式金生物技术有限公司；Ssp I 限制性内 切酶、DNA 标准分子量和 PCR 相关试剂购自 Takara 和 Promega 公司。 1.3 DNA 的提取
柑 橘 黄 龙 病 （Citrus Huanglongbing， HLB） 是 世 界柑橘生产上最具毁灭性的病害之一， 是国内外植
物检疫对象。目前主要分布在亚洲、非洲、大洋洲、南 美洲和北美洲的近 50 个国家和地区， 中国 19 个柑
收稿日期： 2012－08－03 接受日期: 2012－09－17 基金项目： 公益性行业专项(201003067-02，200903004-06)；教育部创新团队(IRT0976) 作者简介： 黄丽，女，在读硕士生，研究方向为分子微生物学。 Tel: 13637785209，E-mail: huangliswu@126.com 觹 通讯作者 Author for correspondence． Tel: 023-68349338，E-mail: tangkez@163.com
分 别 对 反 应 体 系 （Mg2+、dNTPs、Betaine、omp FIP/BIP 和 omp-F3/B3 的浓度等）和反应条件（反应 温度和时间）进行优化，每个因子设置 3 个重复试验。 Mg2+终 浓 度 分 别 为 0、2、4、6、8、10、12、14 mmol·L-1； dNTPs 终 浓 度 分 别 为 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、 1.8 mmol·L-1；甜菜碱（Betaine）终浓度分别为 0、0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1； omp-FIP/BIP 终 浓
序 列 (5′-3′) Sequence(5′-3′) ATTCGGCGTGAACTTGAA GCTATACCTACAGAACCAGC GCCATGATACGACGCTTAGCA-TTGAGTGAGGGAGATCCAAT CTGAAGTCAATATTTCGCAATTGCC-TTTACGCTCACCCTCAGA