贴壁细胞培养

贴壁细胞培养
一、克隆形成抑制试验
原理：克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一，其基本原理是单个细胞在体外持续增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆（集落），这时的每个克隆可含50个以上的细胞，大小在0.3-1.0 mm之间。

通过克隆形成实验，可对单个细胞的增殖潜力做出作定量分析，了解细胞的增殖力和对生存环境的适应性。

这种方法常用于抗癌药物敏感性实验、肿瘤放射生物学实验等。

常见的有平板克隆形成实验和软琼脂克隆形成实验。

本法适用于贴壁生长的细胞，包括培养的肿瘤细胞和正常细胞。

材料与方法
（一）用品：
含15%新生牛血清的RPMI-1640培养液、含10%新生牛血清的RPMI-1640、培养
液PBS、0.25%胰酶、细胞染色液（刘氏染液）、相机、12孔板、EP管。

5-氟尿
嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。

（二）操作：
①. 制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌SW620细胞，用0.25%胰酶消化并吹打成单个细胞，含10%血清的RPMI-1640培养液倍比稀释到所需的体积，使细胞密
2个/mL，接种于12孔板，1000 μL/孔。

度为3×10PBS过一遍，加1ml消化液，弃消化液，10%培养液2ml冲洗细胞，再用枪吸出0.5ml至另一小瓶，3ml 10%
培养液，混合（摇15次，吹15次），取100μl到EP管混合，取10μl细胞计数
倍比稀释（吸出1ml，加2ml培养液。

Mix。

）
吸出1ml，弃剩余液体，将1ml液体倒回小瓶，加2ml培养液。

重复。

直到需要的细胞数。

12600个细胞/3ml，或8400个细胞/2ml。

种板：12孔板，加0.9ml培液，加1ml细胞，不用摇。

②. 待细胞贴壁后加入药物，终体积为2000 μL，设6组0，0.33， 0.66 ，1.33 ，
2.66，
3.99
4.66 μg/ml药物组，每组2复孔，转染后置37℃，5％CO，饱2和湿度条件培养箱内孵育7天。

计数：
满体积2000ul 其中药物浓度100ug/ml 100ul
NS: 0 100 N=2
0.33 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =6.6ul + NS 93.4ul N=2
0.66 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =13.2ul + NS 86.8 ul N=2
1.33 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X = 26.6ul + NS 73.4ul N=2
2.66 μg/ml *2000ul = 100ug/ml * X X =5
3.2ul + NS 46.8 ul N=2
3.99 μg/ml *2000ul =100ug/ml * X X =79.8 ul + NS 20.2 ul N=1
4.66 *2000ul =100ug/ml * X X =93.2 ul + NS 6.8 ul
μg/mlN=1
N=2 管中。

等待加药。

eg:5-FU 6.6 * 3 + NS 93.4 * 3 mix 在EP 干燥：
去培养液，加入PBS洗涤后，染色,③. 吸刘氏染色法。

Liu A Solution 0.5 ml 染色30 s 加染色1 min。

液上面Liu B Solution 1ml于A,轻吹使其充分混合, 滴加水洗, 干燥、拍照
二、细胞传代：培养细胞生长一定时间后，需分离再培养，否则细胞因生存空间不够，细原理为了维持细胞的致营养不足而引起细胞衰老、停止生长甚至死亡。

胞密度过大，存活和生长，必须进行再培养，即将原培养瓶内细胞分离、稀释、接种到新培养瓶内继续扩大培养。

材料与方法（一）用品：管，细胞培EPPBS、0.25%胰酶、、培养液含10%新生牛血清的RPMI-1640 养瓶。

（二）操作：1ml0.25%过一遍，加SW620细胞，PBS①制备细胞悬液：取对数生长期结肠癌冲洗细胞，再用枪吸出10%培养液2ml胰酶消化并吹打成单个细胞，弃消化液，到，取100μl培养液，混合（摇15次，吹15次）3ml 10%0.5ml至另一小瓶，细胞计数用。

EP管混合，取10μl滴管至细胞培养中，用滴管吸取1/32.5ml②细胞传代：在之前制备的细胞悬液至细胞培养瓶，关紧瓶RPMI-164010%瓶，后用滴管吸取3滴管含新生牛血清的 5%CO培养箱中孵育。

℃盖用酒精棉球搽拭后，放入372比色法MTT三、．
原理：MTT比色法是一种检测细胞存活和生长的方法。

实验所用的显色剂是一种能接受氢原子的染料。

化学名3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐。

商品名噻唑蓝，MTT。

活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的兰紫色结晶物，并沉积在细胞中。

而死细胞无此功能。

二甲基亚砜DMSO能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其吸光值，可间接反应活细胞数量，在一定的范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。

与其他检测方法如细胞计数法，3H掺入法，LDH法有良好的相关性。

材料与方法
（一）用品：
1 MTT液：称取250mgMTT，放入小烧杯内，加50ml PBS（0.01M， pH7.4）在电磁力搅拌仪上搅拌30min。

用0.2
2 um的微孔滤器除菌，分装4度保存，2周内有效。

2. 10%新生牛血清的RPMI-1640， 0.25%胰酶，DMSO（分析纯）
3. 5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil, 5-FU）注射液（江苏南通精华制药有限公司），用无菌生理盐水配制成100 μg/ mL溶液，使用前稀释至所需浓度。

（二）步骤
1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。

2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，计数。

3. 配5000个细胞/120ul。

用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml
组每空加入120μl细胞。

培养。

4. 第二天，加入药物40μl。

5，培养48h。

每孔加入MTT（5mg/ml）20μl，继续培养4h。

小心吸弃孔内的上清液。

6. 每孔加入150μl的DMSO，震荡10min，570nm 测吸光值。

满体积160ul 其中药物40μl 药物浓度100ug/ml(对照组加40μlNS)
2μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = 3.2 ul + NS 36.8 ul
4μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = 6.4ul + NS 33.6 ul
8μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X = 12.8ul + NS 27.2 ul
16μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X =25.6 ul + NS 14.4 ul
24μg/ml *160ul = 100ug/ml * X X =38.4 ul + NS 1.6 ul
5-FU 3.2 * 4 + NS 36.8 * 4 mix 在EP管中。

等待加药。

法步骤CCK-8．
1. 接种细胞，用0.25%的胰酶消化细胞，1min,弃胰酶。

2. 用10%小牛血清的1640培养液配成单个细胞，取100μl到EP管中，吹打，计数。

3. 配5000个细胞/120ul。

用96孔板，设0， 2， 4， 8， 16， 24 μg/ml
组每空加入120μl细胞。

培养。

4. 第二天，加入药物40μl。

5，培养48h。

每孔加入CCK-8溶液10μl，继续培养30—90min。

测吸光值。

450nm ，10min震荡6.。