新版动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定作业指导书

作业指导书
O P E R A T I N G I N S T R U C T I O N S
动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定
编号：XZJY084-00-2019
版本：第一版第0次修改
编制：审核：批准：
实施日期：2019.01.01
一、编制目的
为规范动物源性食品中氯霉素类药物残留量的检验方法，编制本指导书。

二、适用范围
本指导书适用于动物源性食品中氯霉素类药物残留量的测定。

三、编制依据
GB/T 22338-2008《动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》
四、实验原理
针对不同动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素残留，分别采用乙腈、乙酸乙酯-乙醚或乙酸乙酯提取，提取液用固相萃取柱进行净化，液相色谱-质谱/质谱仪测定，氯霉素采用内标法定量，甲砜霉素和氟甲砜霉素采用外标法定量。

五、试剂和材料
除非另有说明,本分析中仅使用确认为分析纯的试剂和二次去离子水或相当纯度的水。

5.1 试剂
5.1.1 甲醇：液相色谱级。

5.1.2 乙腈：液相色谱级。

5.1.3 丙酮：液相色谱级。

5.1.4 正丙酮：液相色谱级。

5.1.5 正乙烷：液相色谱级。

5.1.6 乙酸乙酯：液相色谱纯。

5.1.7 乙醚。

5.1.8 乙酸钠。

5.1.9 乙酸铵。

5.1.10 β-葡萄糖醛酸苷酶：约40000活性单位。

5.1.11 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质：纯度≥99.0％。

5.1.12 氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）物质：纯度≥99.0％。

5.1.13 LC-Si固相萃取柱或相当者：200mg，3mL。

5.1.14 EN固相萃取柱或相当者：200mg，3mL。

5.1.15 一次性注射式滤器：配有0.45μm微孔滤膜。

5.2 试剂配制
5.2.1 乙腈饱和正乙烷：取200mL正乙烷于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈，剧烈摇晃，静置分层后，弃去下层乙腈层即得。

5.2.2 丙酮-正乙烷（1+9）：丙酮、正乙烷按体积比1:9混匀。

5.2.3 丙酮-正己烷（6+4）：丙酮、正己烷按体积比6:4混匀
5.2.4 乙酸乙酯-乙醚（75+25）:75mL乙酸乙酯与25mL乙醚溶液混匀。

5.2.5 乙酸钠缓冲液（0.1mol/L）；称取乙酸钠13.6g于1000mL容量瓶中，加入980mL水溶解并混匀，用乙酸调pH到5.0，定容至刻度混匀。

5.2.6 乙酸铵溶液（10mmol/L）：称取乙酸铵0.77g于1000mL容量瓶中，定容至刻度混匀。

5.3 标准品
氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质：纯度≥99.0％；
氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）物质：纯度≥99.0％。

5.4 标准溶液配制
5.4.1 标准储备溶液:分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准物质（精确到0.1mg），用乙腈配成500μg/mL的标准储备溶液（4℃避光保存可使用3个月）。

5.4.2 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准中间溶液:分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准储备溶液，用乙腈稀释成50μg/mL 的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液（4℃避光保存可使用3个月）。

5.4.3 氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准工作溶液:分别准确移取适量的氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素标准中间溶液，用流动相稀释成合适的混合标准工作溶液（现用现配）。

5.4.4 氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）储备溶液：准确移取适量的氯霉素-D5标准物质（精确到0.1mg）,用乙腈配成100μg/mL的标准储备溶液（4℃避光保存可使用12个月）。

5.4.5 氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）中间溶液：准确移取适量的氯霉素-D5储备溶液，用乙腈配成1μg/mL内标中间溶液（4℃避光保存可使用6个月）。

5.4.6 氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液：准确移取适量的氯霉素-D5中间溶液，用乙腈配成0.1μg/mL内标工作溶液（4℃避光保存可使用2周）。

六、仪器和设备
6.1 液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。

6.2 高速组织捣碎机。

6.3 均质器。

6.4 旋转蒸发仪。

6.5 分析天平。

6.6 移液枪：200μL、1mL。

6.7 心形瓶：100mL，棕色。

6.8 分液漏斗：200mL。

6.9 聚四氟乙烯离心管：50mL。

6.10 离心机。

6.11 涡旋混合器。

6.12 固相萃取装置。

七、分析步骤
7.1 试样制备与保存
7.1.1 试样的制备
从原始样品中取出部分有代表性样品，经高速组织捣碎机均匀捣碎成混匀，用四分法缩分出适量试样，均分成两份，装入清洁容器内，加封后作出标记，一份作为试样，一份作为留样。

7.1.2 试样的保存
试样应在-20℃条件下保存。

7.2 测定步骤
7.2.1 提取
7.2.1.1 动物组织（肝、肾除外）与水产品
称取试样5g（精确至0.1g）,置于50mL离心管中，加入100μL氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液和30mL乙腈，匀浆，离心5min。

将上清液移入250mL分液漏斗中，加15mL乙腈饱和的正己烷，振荡5min,静置分层，转移乙腈层至100mL棕色心形瓶中。

残渣中再加入30mL乙腈，振摇3min,离心5min，取上清液转移至同一分液漏斗，振荡5min，静置分层，转移乙腈层至同一棕色心形瓶中。

向心形瓶中加入5mL正丙醇，于40℃水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5mL丙酮-正己烷溶解残渣。

7.2.1.2 动物肝、肾组织
称取试样5g（精确至0.01g）,置于50mL离心管中，加入30mL乙酸钠缓冲液均质2min，加入300μLβ-葡萄糖醛酸苷酶，于37℃温育过夜。

消解样品中加入100μL氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液,20mL乙酸乙酯-乙醚，振摇2min,离心5min。

取上层有机层入心形瓶中，在40℃水浴中旋转蒸发近干，用氮气吹干，加5mL丙酮-正己烷溶解残渣。

7.2.1.3 蜂蜜
称取蜂蜜试样5g（精确至0.01g），置于50mL离心管中，加入100μL 氯霉素氘代内标（氯霉素-D5）工作溶液，5mL水，混匀，再加入20mL乙酸乙酯，振摇2min，离心5min,移取有机层到100mL棕色心形瓶中，于离心管中再加入20mL乙酸乙酯，振摇2min，离心5min，合并有几层于棕色心形瓶中，40℃水浴中旋转蒸发至干，3mL水溶解残渣，混匀。

7.2.2 净化
7.2.2.1 动物组织与水产品
用5mL丙酮-正己烷淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将残渣溶解溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5mL丙酮-正己烷洗脱，收集洗脱液于心形瓶中，40℃水浴中旋转蒸发至近干，氮气吹干，用1mL水定容，定容液过0.45μm滤膜至进样瓶，待测定。

7.2.2.2 蜂蜜
分别用5mL甲醇，5mL水活化EN固相萃取柱，将提取液转移上柱，用5mL水淋涤，用玻璃棒压干1min，用3mL乙酸乙酯洗脱，洗脱液用氮气吹干，用1mL水定容，定容液通过0.45μm滤膜至进样瓶，待测定。

7.2.3 液相色谱-质谱/质谱测定
7.2.3.1 液相色谱条件
a) 色谱柱：Zorbax SB-C18 ，5μm，2.1mm×150mm，或与之相当者；
b) 流动相：水-乙腈-10m mol/L乙酸铵溶液
c) 流速：0.6mL/min。

d) 进样量：20μL 。

e) 柱温：40℃。

7.2.3.2 定性测定
按照上述条件测定样品和建立标准工作曲线，如果样品中化合物质量色谱峰的保留时间与标准溶液的保留时间相比在允许偏差±2.5％之内；待测化合物定性离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于3，定量离子对的重构离子色谱峰的信噪比大于或等于10；定性离子对的相对丰度与浓度相当的标准溶液相比，相对丰度偏差不超过定性时相对离子丰度的最大允许偏差，则可判断样品中存在相应的目标化合物。

氯霉素、甲砜霉素和氟甲砜霉素混合标准工作溶液的液相色谱-质谱/质谱多反应监测（MRM ）总离子流图和重构离子色谱图以及各目标化合物相对保留时间参考氯霉素类标准物质的液相色谱-质谱/质谱总离子流色谱图和重构离子色谱图。

7.3.3 定量测定
氯霉素使用内标法定量；甲砜霉素和氟甲砜霉素使用外标法定量。

八、分析结果的计算及检出限
8.1试样中目标化合物残留量使用仪器数据处理系统或氯霉素残留量按式（2）计算，甲砜霉素和氟甲砜霉素按式（3）计算；
)
2(1000
1000
W A A c V A A c c X s i si si i )
3(1000
1000
W A V A c X s
式中：
X ----样品中待测物残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；
c ----标准工作溶液的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
c si ----标准工作溶液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）;
c i ----样液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）;
A S ----标准工作溶液的峰面积；
A ----样液中待测目标物的峰面积;
A si ----标准工作溶液中内标物的峰面积;
A i ----样液中内标物的峰面积；
V ----试样定容体积，单位为毫升（mL）;
W ----样品称样量，单位为克（g）。

8.2 测定底限
液相色谱—质谱/质谱法对氯霉素测定低限为0.1μg/kg;甲砜霉素和氟甲砜霉素为0.1μg/kg。

8.3 方法定量限
本方法的定量限为2mg/kg。