现代生物技术在病原微生物检测中的应用研究

现代生物技术在病原微生物检测中的应用研究

发表时间：2016-07-25T10:18:54.317Z 来源：《航空军医》2016年第11期作者：陈兰芳胡蓉严小梦[导读] 病原微生物引起的感染性疾病，如不及时治疗常可危及患者的生命。

陈兰芳胡蓉严小梦湖南省津市市人民医院检验科 415400 【摘要】病原微生物的分型检测在临床感染性疾病的诊断中发挥着重要作用。随着人类基因组计划的完成，分子生物学技术为病原微生物的分型检测提供了更多的分子靶点，进一步促进了病原微生物分型技术的发展，逐步取代了传统的分型方法。本文就近年来分子生物学技术应用于病原微生物分子分型的研究进行了综述。

【关键词】病原；微生物学；分子生物学；分子分型病原微生物引起的感染性疾病，如不及时治疗常可危及患者的生命。对病原微生物进行准确分型是探讨其致病性、流行性、变异性以及耐药性等特征的关键。因此，长期以来，学者们在积极寻找快速、准确、灵敏度高、特异性强的病原微生物分型方法。随着分子生物学技术的迅速发展，分子生物学技术应用于病原微生物分子分型成为临床诊断研究中的热点[1]。

一、传统的病原微生物分型方法传统的病原微生物分型主要依据其培养特性和生化特征，常见的分型方法有血清型、噬菌体型和抗菌药物耐受谱型等。其中，血清学分型是依据细菌的菌体抗原（O抗原）、鞭毛抗原（H抗原）以及荚膜抗原（K抗原）对其进行分型的。1938年，Graigie采用噬菌体对伤寒沙门氏菌进行分型，并被广泛应用于细菌的流行病学鉴定与分型。抗菌药物耐受分型通常采用微量稀释肉汤法、纸片法等测定分离菌株的耐药谱加以分型。上述分型技术在临床上应用广泛，具有十分重要的作用，但分辩力较弱，重复性较差，标准化较难。

二、现代病原微生物的分子分型方法近年来，随着分子生物学技术快速发展，新的诊断技术和方法不断涌现并广泛应用于临床微生物的检测，为病原微生物的致病性、流行性、变异性以及耐药性分析等方面提供了重要的信息。目前，应用分子生物学技术对病原微生物进行分型的方法包括：脉冲场凝胶电泳（pulsed-field gel electrophoresis，PFGE）分型、聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）分型、生物芯片分型、多位点序列分型（multilocus sequence typing，MLST）、质粒DNA图谱分型以及限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分型等。

2.1.脉冲场凝胶电泳分型PFGE技术以其重复性好、分辨力强而被誉为细菌分子分型的“金标准”。它可以用于大分子DNA的分离，其分辨范围达到10Mb，而普通琼脂糖凝胶电泳仅能分离小于500Kb的DNA。PFGE的基本原理是通过电场的不断改变，使包埋在凝胶中的DNA分子的泳动方向发生改变，小分子DNA比大分子DNA泳动快，从而在凝胶上按DNA分子大小呈现出特异的电泳图谱。病原微生物的基因组DNA经脉冲场凝胶电泳，使大片段DNA有效分离。DNA条带的密度反映了病原微生物基因组DNA的含量以及分子的大小，最终达到分型的目的。目前，PFGE已被广泛的应用于病原微生物的分型，Swaminathan等[2]已经建立了针对大肠杆菌O157：H7、沙门菌属的Typhimurium血清型、李斯特菌、志贺菌属等病原微生物分型的标准PFGE操作方法。有研究认为PFGE的分辨力强于核糖体分型和随机扩增多态性DNA（random amplified polymorphic DNA，RAPD）分型。当采用1个限制性核酸内切酶的分辨力不强时，可以采用2种限制性核酸内切酶加以提高。当然，PFGE也有一些局限，如耗时长、成本高等。另外，电泳图谱易受操作人员技术水平等因素的影响，这为不同实验室间的比较带来一定困难[3]。

2.2.聚合酶链反应分型PCR技术自1985年发明以来，以其灵敏度高和特异性强受到了人们的高度重视，成为核酸扩增和检测的一种常规方法[4]。用于病原微生物分子分型的PCR方法主要有RAPD分型和重复序列PCR分型2种。RAPD是建立在PCR基础上的1种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子生物学方法。该方法以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列（通常为10个碱基）为引物，在热稳定的DNA聚合酶的作用下进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳后，对其进行多态性分析，反应不同基因组DNA特点，从而对病原微生物进行分型。RAPD可以在物种没有任何基因组信息的情况下分析其DNA多态性，对模板DNA的纯度要求不高，无需DNA探针和分子杂交。重复序列PCR分型是Versalovic于1996年描述的1种细菌基因组指纹分析方法，即PCR扩增细菌基因组中广泛分布的短重复序列，经电泳图谱比较分析揭示基因组间的差异。研究表明重复序列PCR分型与RAPD分型有相同的分辨力，但操作相对复杂。然而，重复序列PCR分型的再现性非常好，这是RAPD无法比拟的。此外，多重PCR、巢式PCR等也可用于病原微生物的分型，虽然各有长处，但也存在分辨力弱、重复性差、结果解析困难等不足，因此，还未广泛应用于临床。

2.3.生物芯片分型生物芯片技术是将生物大分子，如寡核苷酸、cDNA、基因组DNA、肽、抗原以及抗体等固定在诸如硅片、玻璃片、塑料片、凝胶和尼龙膜等固相介质上形成生物分子点阵，当待测样品中的生物分子与生物芯片的探针分子发生杂交或相互作用后，利用激光共聚焦显微扫描仪对杂交信号进行检测和分析。其用于病原微生物分型的基本原理是将代表各个亚型的特异基因制成1张芯片，经反转录就可检测样本中病原微生物的亚型进行辨别。液态芯片（suspension array technology，SAT），又称微球蛋白芯片（protein bead arrays，PBA），是近年来出现的1种新的芯片技术。其原理是用2种荧光染料按照不同比例将直径为5.6μm的微球染成100种颜色，每种颜色的微球共价结合1种生物探针，可以是抗原、抗体、配体，也可以是核酸或酶，分别针对1种待检物。混合载有100种不同颜色的微球，就可以在1个反应孔里同时完成100种不同的生物反应。随后微球成单列通过2束激光照射的管道，计算机采集并处理每种颜色微球的荧光强度变化就可以分别对每个待测物进行定性或定量的检测。该系统可用于多种微生物抗原、抗体和特定基因的联合检测。目前，该方法已应用于临床HPV的分型检测。与固态芯片相比，液态芯片在反应动力学、反应速度、检测敏感性、稳定性以及自动化程度方面都有较大的优势，因此，不少学者看好液态芯片的应用前景。

三、展望由于病原微生物的表型变化总是落后于基因型的变化，因此传统的分型方法逐渐会被分子分型方法所取代。目前，PF-GE分型已经成为众多实验室对病原微生物的主要分型方法。但目前还没有哪种方法能够将分辨力、重复性、可比性、操作简便和费用低廉等几个方面完美结合在一起。随着基因测序技术的快速发展，DNA测序分型将有望替代目前已有的各种分型方法。参考文献：