蛋白质磷酸化改性研究进展

• 1.3 三聚磷酸钠 STP) 三聚磷酸钠( • 三聚磷酸钠早已作为食品添加物应用于食 品工业，从毒理学的观点来看，采用STP 对大豆蛋白进行改性，是安全可行的 。 STP是与蛋白质的胺基或羟基反应的。PH < 9 时，羟基活性弱,当大豆蛋白与STP在 PH = 7～9反应时，只是胺基表现活性， 羟基不起反应。经红外光谱证实,改性蛋 白分子中新增加的磷酸根，而且这个磷酸 根是连接在氮原子上的。反应实质是赖氨 酸残基的氨基磷酸酯化反应。
1 磷酸化改性试剂种类及性质
• 1.1 磷酰氯 (POCl3) • 磷酰氯在有水或无水体系中都可使蛋白质磷酸 化。在有水体系中, 磷酰氯迅速与水反应, 反应 方程式如下: POCl3 +3H2O=H3PO4+3HCl • 由于此反应为放热反应, 且反应后使体系 pH值 大大降低,故若将磷酰氯直接加入蛋白质水溶液 中会使蛋白变性。为了避免此类问题发生,磷酰 氯通常被溶解于有机溶剂中(一般用CCl4)并逐滴 滴加到蛋白水溶液里。在整个反应过程中都要 用碱溶液调节 pH 值恒定并进行温度控制 (通常 在冰浴中进行)。
赖氨酸残基
图1
STP
大豆分离蛋白与STP 的磷酸化反应
• 1.4 环状磷酸三钠 STMP) 环状磷酸三钠( • STMP是FDA许可的食品添加剂。在碱性 环境中, 亲电性强。在与蛋白质反应时, 羟 氨酸磷酸酯化和赖氨酸氨基磷酸化的迹象 即可发生。特别是大豆蛋白中丝氨酸残基 的羟基与 STMP 发生不可逆反应, 胜过苏 氨酸残基的羟基,结果形成稳定的O-磷酸 丝氨酸和等量焦磷酸盐, 而赖氨酸残基的 ε-氨基可更有效地与STMP反应产生酸性 不稳定的ε-氨基赖氨酸磷酸酯。
• 1.2 P2O5/H3PO4 • 五氧化二磷溶解于磷酸中, 用于一些蛋白质的磷酸 化改性如αs1-酪蛋白。此反应要使蛋白质与反应 混合体系(P2O5/H3PO4)在室温下进行几天时间。比 如αs1- 酪蛋白用 P2O5/H3PO4 磷酸化, 要在室温下 反应48h左右。此磷酸化试剂是由75 g五氧化二磷 与100 g 85%的磷酸溶液混合而成。每 0.1 g干燥蛋 白需分散于10 g 反应试剂中, 于室温条件下, 在干 燥器内进行反应。溶剂要用冰水稀释, 并用 100 mol/L的NaOH中和。由于该反应条件非常剧烈, 食 品蛋白质的改性中应用较少 。
注：A：pH稳定性；B：核磁共振；C：分析反应的氨基酸残基；D：红外光谱
3 磷酸化改性蛋白质的功能特性
• 磷酸化蛋白质的功能特性研究主要集中在大豆 蛋白、 花生蛋白和酪蛋白磷酸化后功能特性的 变化。 • 卢寅泉等人采用三聚磷酸钠(STP)对大豆分离蛋 白进行化学改性, 得出 3%大豆分离蛋白磷酸化 程度最大的工艺条件为pH8.0, STP浓度为3%， 35℃下保温3.5 h, 此时的磷酸化程度为57%。改 性前后大豆分离蛋白的水溶性、乳化能力、发 泡能力、持水能力以及流变特性等测定表明, 改 性后大豆蛋白的等电点由 pH 4.5漂移到3.9, 与此 同时, 大豆蛋白的功能持性也有了很大的改善。 用红外光谱, 证实STP与大豆蛋白反应的实质就 是赖氨酸残基进行氨基磷酸化反应。
表2 大豆蛋白磷酸化后功能性的改变
4 磷酸化蛋白质的安全性
• 食物中化学修饰蛋白的使用, 提出了关于改性后 蛋白质营养和安全性的问题, 特别是必需氨基酸 形成衍生物的情况。这些遗留的问题, 不仅有修 饰后蛋白质的安全性问题, 如对消费者是否有毒 性作用,还有在修饰过程中的化学残留问题, 如难 于从终产物中去除未反应试剂。酸水解会产生 致癌物质——氯丙醇, 引起某些异构化作用以及 一些氨基酸被破坏(主要是色氨酸、丝氨酸、苏 氨酸和含硫氨酸)。碱处理会发生β型消去反应, 生成稳定的赖氨酸基丙氨酸的羊毛硫氨酸交联, 降低蛋白质的营养价值。烷基化、酰基化蛋白 质生成ε-氨基衍生物, 使酶水解初始速度有所降 低。
谢 谢
• 在众多的化学修饰方法中, 磷酸化蛋白是很 有前途的用于改善食物蛋白功能性质的方 法。磷酸根基团的引进增加了蛋白质的电 负性, 提高了蛋白质分子之间的静电斥力, 使之更易分散, 因而提高了溶解度、进而改 善了它的乳化性、起泡性。为开发利用我 国蛋白质资源, 解决世界范围内的蛋白质缺 乏危机提供了新途径。
• 潘秋琴等人采用低摩尔比的POCl3/Protein 对花生蛋白进行磷酸化改性, 改性蛋白的 等电点与原样相比有大幅度降低，溶解度、 乳化能力和乳化稳定性显著提高，从而拓 宽了花生蛋白在食品体系中的应用范围。 • 值得一提的是: 当POCl3作为改性磷酸化试 剂时, 大豆蛋白的溶解度、乳化性、起泡 性下降, 粘度、凝胶性增加, 原因可能是蛋 白质之间发生交联。
• 姚玉静等人采用STP对大豆分离蛋白(SPI)进行 磷酸化改性。研究了不同改性程度下大豆分离 蛋白功能特性的变化。结果表明: 磷酸化大豆分 离蛋白等电点由pH4.4漂移至pH 3.86，溶解性、 乳化能力和持水性也有明显提高。 • 刘天一等人采用STP对大豆分离蛋白(SPI)进行 化学改性，运用三因素二次饱和试验设计得出 6 %大豆分离蛋白磷酸化程度最大的工艺条件是 pH810，STP浓度为3%，45℃下反应4 h。同时 研究了改性前后不同程度下SPI的功能性的变化， 结果表明，改性后的SPI的溶解性、乳化能力、 持水能力以及粘度等均有很大的提高，而发泡 性无明显改善。通过红外光谱检测证明，STP与 SPI反应是赖氨酸残基所进行的磷酸酯化反应。
蛋白质பைடு நூலகம்酸化改性研究进展
姓名：陈俊高 专业：粮食、油脂及植物蛋白 学号：810723 导师：迟玉杰教授
Contents
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前言 磷酸改性试剂种类及性质 蛋白质磷化酸作用 磷酸化改性蛋白质的功能特性 磷酸化蛋白质的安全性
0 前言
• 蛋白质的物理、化学和功能性质很大程度上依赖于 它们的蛋白质组成,也就是说,依赖于蛋白质氨基酸残 基侧链结构。因此, 有目的地通过化学修饰等方法修 饰氨基酸残基侧链被认为可以改善其功能性。 • 修饰的目的多样: ①去除蛋白质中不需要的毒性和抗 营养成分; ②通过加减荷电基团; ③增减蛋白质溶解 度; ④改变蛋白质功能性质, 如凝胶作用、 乳化作用、 发泡作用等; ⑤通过与限制性必需氨基酸结合促进营 养性质等等。 • 蛋白质的化学修饰为食品科学家提供了关于食品体 系结构—功能关系的新观念。而且, 一些蛋白质衍生 物可作为新的食品添加成分为食品体系补充必要功 能。
• 在蛋白质改性中磷酸键可以和羟基、氨基、 羧基以及咪唑基结合。 • 在酪蛋白、乳清球蛋白、鲱精蛋白磷酸化 改性中, 磷酸化试剂专一地与羟基反应；在 乳球蛋白、乳清白蛋白、血色素、胰岛素、 核糖核酸酶磷酸化改性中, 磷酸化试剂专一 地与氨基反应; 而在大豆蛋白、花生蛋白、 精蛋白、溶解酵素磷酸化中磷酸键既可以 和氨基反应也可以和羧基反应。
图2 大豆蛋白在碱性条件下 ,同环状磷酸三钠酯化和氨基酸酯化
2 蛋白质磷化酸作用
• 蛋白质的磷酸化是通过有选择地利用蛋白 质侧链活性基团来引进大量的磷酸根基团 进行反应的,一般可以通过如下方法测定: ① 磷酸键的pH稳定性; ②通过分析损失的蛋白 质残基(羟基、氨基、酪氨酰基、咪唑基、 羧基、巯基) ;③红外光谱;④核磁共振;⑤蛋 白质水解。
表1 磷酸化蛋白质改性位点
磷酸化蛋白
大豆蛋白 花生蛋白 酪蛋白 乳球蛋白 溶解酵素 血清白蛋白 血清球蛋白 鲱精蛋白 核糖核酸酶 6-磷酸葡萄糖脱氢酶
检测方法
D D A,B,D A,B A,C A,C A A,B,D A,C A,C Ser(Thr)-O-PO32-和-NH-PO32Ser(Thr)-O-PO32-和-NH-PO32-
磷酸键位点
Ser(Thr)-O-PO32-和Ser(Thr)-O-P2O62-NH-PO32Ser(Thr)-O-PO32-、-NH-O-PO32-、O(NH)- P2O62-和O(NH)- P3O94NH-PO32Ser(Thr)-O-PO32Ser(Thr)-O-PO32-、Ser(Thr)-O-P2O63-、Ser-(NH)- P3O94NH-PO32His-PO32-