枯草芽孢杆菌营养缺陷型突变株的筛选

题目：细菌营养缺陷型菌株的诱变和筛选鉴定

一、实验原理：筛选营养缺陷型菌株一般具有四个环节：诱变处理、营养缺陷性的浓缩、检出、鉴定缺陷型。本实验选用亚硝酸钠为诱变剂来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，逐个测定法检出缺陷型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。

二、实验器材：离心机，冰箱，恒温箱，高压灭菌锅；接种针，三角烧瓶，试管，离心管，移液管，培养皿，枪头

三、菌种：大肠杆菌

四、所有用到的培养基：（分别列出配方）

1. LB培养液：酵母膏，0.5g；蛋白胨，1g；NaCl，0.5g；水，100ml，pH7.2 121℃灭菌15min

2. 基本培养基：葡萄糖0.5 g，(NH4)2SO4 0.1 g，柠檬酸钠0.1 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，K2HPO4 0.4 g，KH2PO4 0.6 g，重蒸水100 mL，pH 7.2，110℃灭菌20 min。配固体培养基时需加2%洗涤处理过的琼脂。全部药品需用分析纯，使用的器皿需用蒸馏水或重蒸水冲洗2~3 次。

3. 无N基本液体培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; 葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min

4. 2N基本培养基：K2HPO4,0.7g；KH2PO4,0.3g; 柠檬酸钠3H2O,0.5g；MgSO4 7H2O,0.01g; (NH4)2SO4,0.2g;葡萄糖2g；水100ml，pH7.0 110℃灭菌20min

5. 完全培养基同LB培养基，配置固体培养基，需加2%的琼脂。

6. 补充培养基(简称SM)：为满足某特定营养缺陷型菌株的营养要求而在基本培养基中加入某—种或几种营养成分的培养基称补充培养基。

7.醋酸缓冲液(pH4.5)（取醋酸钠18g,加冰醋酸9.8ml,再加水稀释至1000ml）、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液(68.995×0.1=6.8995g/L)、0.07 mol/L酸氢二钠溶液(pH8.6)(141.96×0.07=9.9372g/L)

五、实验步骤

1th day: 各种所需培养基、试剂的配制及所需器材灭菌

2th day：菌体活化与培养：取一环E.coli于5mlLB液体三角瓶中，37℃培养过夜，14~16h.

3th day：早上添加5mlLB液，充分混匀后，分装到两只三角瓶，继续培养5小时。将两瓶菌液分别倒入离心管中，离心（3500rpm）10分钟，弃上清，其中一管加生理盐水5ml，打匀沉淀，然后倒入另一离心管中，两管合并成一管。（菌体密度控制在10*7~10*8个/mL）。

菌液浓度测定比浊计数法（OD600=1,枯草芽孢杆菌浓度为6×10*个/mL）。

亚硝酸钠(NIT)诱变:取菌悬液1mL、醋酸缓冲液(pH4.5) 2 mL、0.1 mol/L亚硝酸钠溶液1 mL,于26摄氏度下保温25 min后每个样中,加入0.07 mol/L磷酸氢二钠溶液(pH8.6)20 mL,以终止反应。然后取诱变菌液 1 mL 稀释涂布于LB琼脂平板上，在30 ℃下培养48 h 后进行菌落计数，计算致死率.

（三）营养缺陷型浓缩（淘汰野生型）

3th day：

延迟处理：吸菌液5ml于离心管中，3500rpm离心10min，弃上清。离心洗涤两次（加生理盐水至原体积，打匀沉淀，离心，弃上清，重复一次），最后加生理盐水制成5ml菌悬液。取0.1ml菌液于5ml无N培养基中，37℃培养12h。4th day：

初筛：加入等体积2N基本培养液5ml，加5万U/ml青霉素钠盐溶液100ul(1 国际单位（IU）= 0.60μg 结晶青霉素G钠盐＝0.625μg 结晶青霉素G钾盐)，使青霉素在溶液中的最终浓度约为500U/ml(青霉素母液过滤除菌后加入），再放入37℃培养。

（四）营养缺陷型检出

5th day：从培养12、16、22小时（根据实际情况，选择2-3个时间段）的菌液中分别取0.1ml菌液到基本及完全培养基两个培养皿中，涂布，37℃培养。

7th day：检出营养缺陷型。上述平板培养36－48h后，进行菌落计数。

（五）复证：选取完全培养基上长的菌落数大大超过基本培养基的那一组，用灭菌牙签挑取完全培养基上长出的菌落100个分别点种于基本培养基和完全培养基上（先基本，后完全），37℃培养。

9th day：选在基本培养基上不长，完全培养基上生长的菌落在基本培养基上划线，37℃培养24h，仍不长的是营养缺陷型。

(六) 生长谱测定

使用以下四种营养物质：

a. 不含维生素的酪素水解液或氨基酸混合液酪素水解液的配制：1g干酪素溶于碱性缓冲液(Tris-HCl、PBS)中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL, 30℃水解lh。（用于配制培养基时，其用量为1000mL培养基中加入100mL 以上水解液。）

b. 维生素混合液

c. 0.1%碱水解酵母核酸液

d. 酵母浸出物

10th day：生长谱的测定：将检出的营养缺陷型菌落接种于5ml LB液试管中，37℃培养14－16h。

11th day：培养16h的菌液离心。3500rpm，10min，弃上清，加生理盐水，打匀沉淀，再次离心。加5ml生理盐水制成菌悬液。取其1ml于培养皿中，加入融化后冷却到40－50℃的基本培养基，混匀，平放，共二皿。（平板表面分别沾上沾有以上四种营养物质的滤纸片，30℃培养24h，经培养后营养物质周围有生长圈，即表明为此类物质的营养缺陷型菌株）。将皿底分成分格用接种环依次放入少许营养物质，37℃培养24h，观察生长情况，确定是哪种氨基酸营养缺陷型。

诱变处理的记录：

菌落数

12h 16h 22h

完全培

养基

基本培

养基