目的基因的克隆转化及重组子筛选

目的基因的克隆、转化及重组子筛选

一．实验目的：

(1)学习和掌握DNA片段胶回收的方法。

(2)学习DNA连接的有关技术。

(3)掌握用CaCl2 法制备感受态细胞的原理和方法。

(4)学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。

(5)掌握质粒提取的基本方法。

(6)学习和掌握限制性内切酶的使用方法。

二．实验原理：

(1)cDNA的TA克隆:Taq酶能够在PCR产物的3’末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有 3’T突出端的载体，在连接酶作用下，通过粘性末端连接，把PCR产物插入到质粒载体的多克隆位点，称为 T-A克隆。可用于PCR产物的克隆和测序。

(2)感受态细胞制备原理：细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态,细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，细胞膨胀，细胞壁通透性增强,在冷热变化刺激下细胞膜表面产生裂隙，使外源DNA进入。

(3)蓝白斑筛选:载体带有一个LacZ基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码α-互补肽；宿主细胞编码C端部分序列。诱导物IPTG 和乳糖的结构相似，可以与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，从而解除阻遏蛋白的作用，使载体得以合成α-互补肽，与宿主细胞编码的C端部分结合形成β-半乳糖苷酶，而X-Gal是β-半乳糖苷酶的显色底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会产生蓝色产物。可用于重组克隆的筛选，重组克隆无法产生α-互补肽，因而无法使X-Gal显色，培养基上表现为白色菌落。

三．实验材料：

大肠杆菌DH5a、LB培养基、0.1mol/L CaCl2DNA割胶回收试剂盒，试管，Amp/IPTG/X-Gal，三角玻璃棒，玻璃珠，牙签，1µl pMD19-T Vector、质粒提取试剂盒。

四．实验步骤、现象、结果及分析：

(1)cDNA电泳及胶回收

1. 提取总RNA，反转录cDNA，用设计好的引物扩增出不同的目的片段。取目的基因产物进行琼脂糖电泳，紫外灯下切胶。

2.把所割胶放入1.5 ml EP管，称重如下表一。

表一：cDNA琼脂糖凝胶重量

空管2管3管

重量（g）0.9045 1.2280 1.2961

净重（g）0.3235 0.3916

3.按1g/1ml 的量，大致各加入400µl Binding Buffer，65℃水浴7min；（每隔2－3 min，摇一下）；

4.把溶液转移至spin-column，10000g 离心1 min ，倒出套管内残液；

5.在柱子中加入300µl Binding buffer，10000g 离心1min，倒出套管内残液；

6.在柱子中加入700ul 的SPW 溶液，放置3min，10000g 离心1min ，去残液；

7.10000g 离心1min（去乙醇）；

8.把柱子放入干净的1.5ml EP 管。加Elution Buffer 20µl。室温放置1min，10000g 离心1min。

9.检测DNA 的纯度和浓度，如下表二所示。选取质量好的2号组进行接下来的连接转化。

表二：cDNA 吸光度测定

（2）感受态细胞制备

1.从新鲜培养的LB 平板上挑单个DH5a 大菌落接种到3mlLB 培养液中，37 ℃ 剧烈振荡培养过夜（教师准备）。

2.取过夜培养的大肠杆菌DH5a 按 1：50 取1ml 菌液接种到 50ml LB 培养基中，37 ℃ 振荡培养，1hr 后用分光光度计测其OD 值为0.182，1.5 hr 后再测其OD 值，为0.304，到达其对数生长期（细菌对数生长期 OD 600 为 0.2-0.4）。

3.分别取1ml 菌液至1.5 ml 离心管中标记为1号、2号、3号，培养物冰上放置 10 min ，5000 r/min ，离心 2 min ，用枪头吸取废液，弃去，收集底部菌体。

4.分别加入500µl 预冷的 0.1 mol/L CaCl 2 ，用枪头吹散，使菌体悬浮于预冷的 CaCl 2 中，冰上放置10分钟。

5.离心机5000r/min ，离心 2min ，用枪头吸取弃上清，分别加入100µl 预冷的 0.1 mol/L CaCl 2，小心用枪头吹散，0℃ 保存 3hr 。

（3）连接和转化 组别 实验组 正对照组

负对照组 操作 连接：从2号胶回收DNA EP 管中取4µl ，加入1µl pMD19-T Vector 、5µl Solution Ⅰ组成10µl 连接反应体系，在16℃下进行连接反应；

转化：30min 后加入1号100µl 感受态细

胞EP 管中，以手指轻轻触碰混匀，冰中

放置30min 进行转化，接着42℃热激

45sec ，再在冰中放置1min ，最后加入

390µl LB 液体培养基于37℃振荡培养50min 。

取1µl(5ng/µl)

质粒加入2号

100µl 感受态细

胞EP 管中。 无需取任何物质加入3号100µl 感受态细胞EP 管中。 样品组-100µl ：

从上述500µl 体

系中取100µl 加入

LB/Amp/IPTG/X-G

al 平板，最后加入

玻璃珠，摇动混匀，

于37℃倒置、过夜

培养。 样品组-200µl ： 从上述500µl 体系中取200µl 加入LB/Amp/IPTG/X-G al 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。 从上述101µl 体系中取50µl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。 从上述100µl 体系中取100µl 加入LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀，于37℃倒置、过夜培养。

注：LB/Amp/IPTG/X-Gal 平板配制：

取固体LB 培养基于微波炉中融化，在超净工作台中冷却至55℃左右，加入80µl 氨苄青霉素，混匀，倒入四个已消毒并做好标记的平板，分别是：样品组100µl 、样品组200µl 、

2组 3组 A260/A280 1.864 1.867 浓度（ng/µl) 146.718 128.242