HPLC法测定菊苣根中咖啡因含量及其抑菌活性的研究_纪可

established in this study was favorable for the determination of caffeine in chicory root.Caffeine extraction in chicory
root had obvious antibacterial activity on common food contamination bacteria.
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
乙醇、乙酸 国产分析纯； 甲醇、N－ N－ 二甲基甲 酰胺 色谱纯； 牛肉膏、蛋白胨、琼脂； 菊苣根 吉林 省和龙市东胜乡； 咖啡因对照品 天津一方科技有
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限公司。 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis） 、金黄色葡萄球
菌 （ Staphylococcus aureus ） 、大 肠 埃 希 菌 （ Escherichia coli ） ； 青 霉 菌 （ Penicillium sp ） 、 酿 酒 酵 母 （ Saccharomyces cerevisiae） 长春工业大学化学与生 命科学学院生物实验室提供。
图 1 紫外光谱分析结果图 Fig.1 The UV spectral analysis result
2.2 咖啡因的检识结果
按 1.2.5 步骤操作，当向待测液中滴加 2 滴检识 液后，烧杯中出现难溶的橙红色络合物，表明试样液 中存在咖啡因成分的。
2.3 咖啡因的红外光谱图分析
菊苣根咖啡因提取物红外光谱图（ 图 3） 经数据 库检索后与咖啡因标准品红外图谱（ 图 2） 特征峰基 本符合，图 谱 解 析 如 下： 3424cm －1 为 酰 胺 键 中 N － H 的伸缩振动产生的吸收峰； 2963cm －1 为甲基的 C － H 伸缩振动产生 的 吸 收 峰； 1659cm －1 为 碳 碳 双 键－ C = C－ 伸缩振动产生； 1653cm －1 为叔酰胺中－ C = 0 的 伸 缩振动产生； 1431cm －1 为甲基的 C－ H 弯曲振动产生， 由于氮原子与甲基相连，吸收带向高波数位移明显； C－ N 伸 缩 振 动 位 于 1350 ～ 1100cm －1 ，与 芳 环 碳 或 不 饱和碳相连的 C － N 伸缩振动位于 1350 ～ 1250cm －1 ， 咖啡因结构中 C－ N 还连有甲基，甲基是供电子基，使 C－ N向高波数位移。由 谱 图 可 知 待 测 物 结 构 中 含 有
HPLC 法测定菊苣根中咖啡因含量 及其抑菌活性的研究
纪 可，邱芳萍* ，杜 林，邢 燕 （ 长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012）
摘 要： 应用红外光谱和高效液相色谱法对菊苣根中咖啡因进行定性及定量分析； 同时采用一系列真菌和细菌，研究 了咖啡因提取物的抑菌活性。结果表明，咖啡因保留时间为 3.787min，在 25～125μg / mL 质量浓度范围内线性关系良 好（ Ｒ2 = 0.9995） ，回收率在 97.9% ～101.2% 之间，样品在 4h 之内稳定性良好。相对标准偏差均小于 1.0% 。在此条件 下检测出的菊苣根咖啡因含量为 2.14mg / g。该方法简单、快捷、准确，适合菊苣根中咖啡因含量的测定； 菊苣根咖啡因 提取物对食品常见污染菌有明显的抑菌作用。 关键词： 菊苣根，咖啡因，高效液相，红外光谱，抑菌活性
fungi and bacteria.Ｒesults showed that caffeine retention time was 3.787min，linear relationship was well between
mass concentration 25～125μg / mL（ Ｒ2 = 0.9995） .Ｒecovery was between 97.9% ～101.2% .Sample had good stability
收稿日期： 2013－03－11 * 通讯联系人 作者简介： 纪可（ 1987－ ） ，女，硕士研究生，研究方向： 功能食品与生物
技术。 基金项目： 吉林省科技型中小企业技术创新基金项目（ SC201102038X） 。
病［6］ ，并有良好的 抑 菌 效 果［7］ ，在 机 体 的 多 个 系 统 中 发挥着广泛 的 作 用，研 究 和 开 发 天 然 咖 啡 因 已 成 为 食品药品 界 的 研 究 热 点。 所 以，从 废 弃 的 菊 苣 根 中 提取的天然 咖 啡 因 替 代 合 成 的 咖 啡 因，添 加 到 咖 啡 饮品中或制成天然植物型抑菌剂等，具有天然性、安 全性和功能性，在食品，药学等方面有着巨大的应用 潜力，市 场 前 景 广 阔。本 实 验 以 咖 啡 因 标 准 品 为 对 照，采 用 紫 外 全 波 长 扫 描，红 外 图 谱，高 效 液 相 色 谱 法对菊苣根 中 咖 啡 因 进 行 分 析 检 测，考 察 了 菊 苣 根 咖啡因提取 物 性 质 及 结 构 与 标 准 品 的 相 关 性，并 采 用一系列真 菌 和 细 菌，对 菊 苣 根 咖 啡 因 提 取 物 的 抑 菌作用进行 分 析，为 更 好 地 应 用 菊 苣 根 中 咖 啡 因 提 供参考依据，为 菊 苣 根 茎 的 综 合 利 用 提 供 更 为 广 阔 的市场前景。
Abstract： IＲ spectra and high － performance liquid chromatography was applied for the quality and quantity of
caffeine in chicory root.The antibacterial property of caffeine extraction in chicory root was tested with a series of
Determination of caffeine in chicory root by high performance liquid chromatography and its antibacterial activity research
JI Ke，QIU Fang－ping* ，DU Lin，XING Yan （ School of Chemistry＆Life Science，Chang Chun Univerisity of Technology，Changchun 130012，China）
Key words： chicory root； caffeine； HPLC； IＲ spectra； antibacterial activity
中图分类号： TS201.3
文献标识码： A
文 章 编 号： 1002－0306（ 2013） 21－0301－04
菊苣为 菊 科 菊 苣 属 多 年 生 草 本 植 物，我 国 主 要 分布于西北、东北各省。菊苣根粉可用做冲剂，有健 胃、消食和 去 脂 等 药 理 功 效［1－2］，《中 国 大 药 典 》记 载 菊苣根部 含 大 量 有 效 的 活 性 成 分，如 类 黄 酮、苷 类 等。但对其化学成分的研究及对其提取物的药理活 性方面的研究未见报道［3］。由于粉碎后沸水煮时有 淡淡的咖啡香，并且有提神醒脑的功效，常被当地居 民当做饮料饮用。但大部分菊苣根茎仍被当做废弃 物丢掉，资 源 严 重 浪 费。 咖 啡 因 是 菊 苣 根 中 一 种 重 要的营养成 分，目 前 国 内 外 尚 未 见 对 菊 苣 根 中 咖 啡 因及其抑菌性关系的研究报道。少量的咖啡因可使 身心处于兴奋状态［4］，刺激机体的中枢神经系统，增 高机体血糖水平，集中注意力［5］； 可作为中枢神经系 统的兴奋药 剂，能 促 进 胃 液 分 泌 和 治 疗 偏 头 痛 等 疾
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within 4 hours.Ｒelative standard deviation was less than 1.0% . Under this condition，chicory root caffeine content
was 2.14mg / g. The method was simple and rapid in operations and accurate in determination，the method
啡因提取物的滤纸片均匀贴在每个涂有菌液的平板 上，酵母和霉菌培养在 28℃ 下 48h，细菌培养在 36℃ 下 24h。以无菌水做空白对照，观察抑菌效果，测定 抑菌圈直径。以上操作均在无菌条件下进行。
2 结果与分析
2.1 检测波长的选择
按 1.2.4 步骤操作，二者均在 274nm 处有最大吸 收 波 长，此 处 为 生 物 碱 络 合 物 的 特 征 吸 收 峰 （ 如 图 1） 。280nm 处无紫外吸收，说明无蛋白质吸收峰， 在 260nm 处无吸收峰，说明无核酸存在。故选择咖 啡因检测波长为 274nm。
称取适量烘干后提取物，加 200.0g / L 的亚铁氰 化钾 溶 液 2.0mL 和 200.0g / L 的 碱 式 乙 酸 铅 溶 液 2.0mL 除去菊苣根中的蛋白质［9］，过滤，滤液超声脱 气后备用。配制浓度为 4mg / mL 的样液［10］，然后 用 0.45μm 滤膜过滤，作为待测样液，在色谱条件下，进 样 3 次，求出峰面积平均值，计算咖啡因含量。 1.2.4 检测波长的选择 以蒸馏水为空白，在 190 ～ 1000nm 波长范围内分别对咖啡因标准品和菊苣根 咖啡因提取 物 进 行 紫 外 全 波 长 扫 描［11］ ，观 察 最 大 吸 收波长。 1.2.5 咖啡因的检识 称取 7.3g 碘化铋钾，加冰醋 酸 10mL 后用 60mL 蒸馏水溶解，制成检识液，向待测 样液中滴加 2 滴检识液，观察现象。 1.2.6 咖啡因红外图谱检测 分别将干燥的咖啡因 标准品与菊苣根咖啡因提取物粉末与溴化钾混合在 玛瑙 研 钵 中 研 磨 均 匀，经 压 片 成 薄 片，在 4000 ～ 400nm 波 长 范 围 内 进 行 红 外 光 谱 扫 描，观 察 谱 峰 情况。 1.2.7 菊苣根咖啡因提取物抑菌活性的研究 将培 养基制成平板［12］，酵母和霉菌用马铃薯培养基，细菌 用牛肉膏蛋 白 胨 培 养 基，各 菌 种 用 无 菌 生 理 盐 水 配 制成 107 ～ 108 CFU / mL 孢子悬液，吸取 0.2mL 孢子悬 液均匀涂抹到灭菌的平板上，将 3 片浸有菊苣根咖
1.2 实验方法
1.2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱： C18 色 谱 柱 （ 250mm × 4.5mm，20μL） ； 流动相： 甲醇∶ 水∶ 乙酸∶ N－ N－ 二甲基 甲 酰 = 30 ∶ 70 ∶ 0.05 ∶ 0.25； 柱 温： 25℃ ； 检 测 波 长： 274nm； 流速： 1mL / min； 进样量： 10μL。 1.2.2 标准液的配制 精密称取咖啡因标准品 5mg， 用甲醇∶ 水 = 70 ∶ 30 的混合溶液溶解并定容于 10mL 容量瓶中，分别移取 0.5、1.0、1.5、2、2.5mL 的标准液 分别定容于 10mL 容量瓶中，超声波脱气 10min 后再 通过 0.45μm 水系膜过滤［8］，进样量为 10μL，以咖啡 因质量浓 度 为 横 坐 标，峰 面 积 为 纵 坐 标，绘 制 标 准 曲线。 1.2.3 样品前处理 将原材料洗净后切成片，烘干后 粉碎，过 60 目筛，用浓度为 85% 的乙醇按料液比为 1∶20的比例在索氏提取器中提取，过滤，以 6000r / min 转速离心 10min 后减压浓缩得提取物浸膏，置于烘 箱中烘干备用。