海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168中的高效表达_谢海伟

55海洋生物抗菌肽在枯草杆菌BS168中的高效表达

谢海伟, 文 冰, 王 娣, 钱时权, 杨贤松, 许 晖

(蚌埠学院 生物与食品工程系, 安徽 蚌埠 233030)

摘要: 为了实现基因工程高效制备tachyplesin , Ⅰ采用tachyplesin Ⅰ基因串联表达的方法, 以穿梭表达载体pSBPTQ 为表达载体, 通过RT-PCR 扩增tachyplesin Ⅰ基因(tac )和采用直接退火的方法合成tachyplesin Ⅰ串联基因(2tac ), 构建重组表达载体pSBPTQ-TAC 和pSBPTQ-2TAC, 转化到枯草杆菌BS168实现高效表达。实验结果表明: 基因tac 和2tac 在枯草杆菌中表达成功, TAC 和2TAC 抗菌肽表达量分别约为8.5％、15.8％, 经高效液相色谱分析表达产物在发酵上清液中的含量约为 5.46、10.36 mg/L; 表达产物TAC 和2TAC 对大肠杆菌K88和金黄色葡萄球菌都具有明显的抑菌作用, 2TAC 经BrCN 水解产物抑菌活力高于TAC, 而2TAC 的表达产量大约是TAC 的 1.89倍。这表明通过tachyplesin Ⅰ串联表达产物降低了自身对宿主的毒性, 可以提高tachyplesin Ⅰ的表达产量。

关键词: 抗菌肽tachyplesin ; Ⅰ表达载体构建; 串联表达; 抗菌活性 中图分类号: Q786 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2011)03-0055-09

马蹄蟹(Horseshoe crab )是一类远古的海洋节肢动物。马蹄蟹血细胞中分离提取的一类抗菌肽[1], 具有抗细菌、抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞分化的生物活性

[2]

。抗菌肽

tachyplesin Ⅰ因相对分子质量小不具备抗原性, 对原核生物细胞有很高的杀菌活性, 对真核生物的正常细胞则无明显毒副作用。抗菌时一般没有特殊受体, 不会诱导抗药菌株的产生, 是一类具有巨大潜在应用价值的抗菌肽。但由于马蹄蟹是一种珍贵的海洋生物, 物种稀少, 是濒临灭绝生物, 且tachyplesin Ⅰ的分离纯化过程繁琐且费用较高; 通过化学合成制备, 价格昂贵, 生物活性低; 因此采用基因工程制备tachyplesin Ⅰ成为一种可行的方案[3]。

目前, 利用基因重组技术在体外大量制备活性多肽是生物制品研究的热点之一。对于分子质量较小的多肽, 如果用常规方法构建单拷贝基因的重组质粒, 则目的基因在细胞中的表达量很低, 无法体现基因工程产量高的优势。因此, 本文建立了一种构建串联基因的方法, 以实现小分子多肽在体外的高效表达, 为小肽的串联表达提供了理论和实践依据。本研究为了克服基因工程制备tachyplesin Ⅰ的缺陷, 设计构建tachyplesin Ⅰ基因串联表达载体, 并将重组基因成功转化到分泌型表达系统枯草杆菌BS168中, 实现了抗菌肽tachyplesin Ⅰ的高效分泌表达。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株和质粒

克隆宿主菌Escherichia coli. DH5α、大肠杆菌E.coli K88、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus ) 为本室保存; 枯草杆菌Bacillus subtilis BS168为表达宿主菌, 由上海生命科学院植物生理与生态研究所惠赠; TA 克隆载体pUCM-T 购自上海生工公司; 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭质粒pSBPTQ [4]由中山大学罗进贤教授惠赠。 1.1.2 培养基和主要试剂

马蹄蟹购自广东省深圳市水产品市场; 枯草杆菌感受态制备用GMI 、GMII 培养基[5]; 发酵用MSR 培养基[6]。cDNA 合成试剂盒及各种工具酶均购自TaKaRa 公司; Trizol reagent 购自Invitrogen 公司; 蛋白分子质量标准、mRNA 纯化试剂盒购自

收稿日期: 2010-04-20; 修回日期: 2010-08-03

基金项目: 安徽省高校自然科学研究资助项目(KJ2009B014); 安徽省高等学校省级食品科学与工程特色专业建设点资助项目(20101091); 安徽省食品科学与工程教学团队项目资助(20101094); 蚌埠学院优秀人才基金项目及院级教育教学研究项目(JYLC1015); 高校省级优秀人才基金项目(2011SQRL166)

作者简介: 谢海伟(1978-), 男, 吉林桦甸人, 讲师, 博士, 主要从事多肽和酶工程方面研究, E-mail: xiehaiwei324@

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海洋科学/ 2011年/第35卷/第3期

Promega 公司; CM Sepharose 购自Amersham Bio-sciences; 其他生化试剂(分析纯)购自上海生工; 实

验中所用引物(由上海生工合成), 各引物设计如表1所示。

表1 所用引物表 Tab. 1 PCR primers

引物 碱基序列

用途

M13 Forward(-20) 5’-gtaaaacgacggccag-3’ amplifing 2tac gene from pUCM-2TAC M13 Reverse(-48)

5’-caggaaacagctatgac-3’

amplifing 2tac gene from pUCM-2TAC

Tac-1

5’-gctctagagc aatctagaccaaatggtgcttccgtg-3’ amplifing tac gene

Tac-2 5’-ggggtacc aacacggcaacgacgg-3’ amplifing tac gene

1.2 方法

1.2.1 抗菌肽tachyplesins Ⅰ基因的RT-PCR 扩增

从马蹄蟹围心腔采集血液, 8 000 r/min 离心 10 min 获得血细胞[7], 用Trizol 处理提取总RNA, 以mRNA 纯化试剂盒获得mRNA 。反转录合成cDNA, 进一步以cDNA 为模板, 参考Genbank 收录的tachyplesi n Ⅰ基因序列, 设计了上下游引物Tac-1和Tac-2, 见表1。并设计了Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ酶切位点和保护碱基。PCR 扩增获得的目的基因tac , 经2.5%琼脂糖凝胶电泳分析, 电泳检测后测序。 1.2.2 串联基因(2tac )的设计

参照Genbank 上公布的基因序列, 设计合成两条完全互补单链tachyplesins Ⅰ串联基因, 5’端设计Xba Ⅰ黏性末端, 3’端设计Kpn Ⅰ黏性末端。通过上海生工公司合成带有上述黏性末端的完全互补的碱基序列, 退火合成带有黏性末端的双链串联tachyplesins Ⅰ基因。方法合成如下: 取等量摩尔浓度25 µmol/L 的正反义引物各 4 µL, 添加超纯水至 40 µL 。退火条件: 80℃水浴退火5 min, 然后自然冷却至30℃, 其过程大概3 h 。退火合成串联基因(2tac )克隆连接到pUCM-T 上进行初步鉴定及目的串联基因的扩增。

2TAC 正义链:

5’-aaaaaGCTCTAGAGC AA aaatggtgcttccgtgtttgctacc gtggtatctgctaccgtcgttgccgtaac ATG aaatggtgcttcagagtatg ctacaggggaatttgttatcgcagatgtcgaaac GGTACC-3’

2TAC 反义链:

5’-aaaaaaGGTACC gtttcgacatctgcgataacaaattcccctgtag catactctgaagcaccattt CAT gttacggcaacgacggtagcagatacca cggtagcaaacacggaagcaccattttt GCTCTAGAGC-3’

1.2.3 串联基因2tac 的克隆鉴定及体外PCR 扩增

克隆载体pUCM-T 经限制性内切酶Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切后, 和tachyplesi n Ⅰ基因tac 及2tac 经T4 DNA 连接酶连接。转入大肠杆菌DH5α培养, 经过蓝白斑筛选得阳性克隆, 培养提取质粒。经双酶切初步鉴定, 再通过测序进一步验证克隆片断的正确性。所得克隆质粒命名为pUCM-2TAC 和pUCM- TAC 。

1.2.4 表达载体的构建及鉴定和重组质粒转化

以pUCM-2TAC 质粒模板, 通过引物M13经PCR 扩增得到串联基因2tac , PCR 反应条件: 94℃预变性10 min; 94℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 共进行35个循环; 最后72℃延伸10 min 。将PCR 产物和表达载体pSBPTQ 同时进行Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切, T4 DNA 连接酶连接, 大肠杆菌转化按Sambrook 的方法进行[8]。转化后筛选阳性克隆, 双酶切鉴定, 测序验证。所得质粒命名为pSBPTQ- 2TAC, 重组表达质粒pSBPTQ-TAC 和pSBPTQ- 2TAC 转化枯草杆菌BS168的方法参照Harwood [9]方法进行。

1.2.5 诱导表达及SDS-PAGE 电泳分析

挑取新鲜转化的枯草杆菌工程菌BS168/

pSBPTQ-TAC 和BS168/pSBPTQ-2TAC 单菌落接种于含卡那霉素(10 mg/L)的LB 培养基中, 37 ℃ 250 r/min 培养过夜, 作为种子液。然后种子液按5 %接种量转接于含卡那霉素(10 mg/ L)的发酵培养基(MSR)中, 37 ℃ 250 r/ min 振荡培养2~4 h, 加蔗糖至终浓度2 %诱导表达[10], 每隔12 h 依次取样, 收集的发酵液经10 000 r/min 离心15 min, 取发酵液上清进行Tris-Tricine SDS-PAGE(16.5%)电泳检测, 以确定最佳诱导时间。用含质粒pSBPTQ 的对照菌体和标准蛋白作对照。

1.2.6 重组tachyplesin Ⅰ的分离纯化

收集发酵液12 000 r/min, 离心15 min 。向发酵上清液中依次加入硫酸铵使终浓度达到35%、45%、55%、65%、75%, 12 000 r/min 离心30 min, 收集沉淀, 用pH7.4的Tris-HCl 缓冲液溶解沉淀。将盐析浓缩效果最好的溶液装入透析袋中进行透析。透析产物上CM -Sepharose 层析柱, 用10 mmol/L Tris-HCl