分子生物学优秀课件

说明：
1.穿梭载体（sbuttle vector） 指在两种宿主生物 体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因 （穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB219
2.YAC Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和 PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十 分有用，在HGP中发挥主要作用。
注：前三个特点必不可少。
HindIII BamHI
SalI
pBR322
(4.36 kb)
ori
载体的分类
分类依据 1.按功能分成
类
别
（1）克隆载体 （2）表达载体
2.按进入受体细胞类 型分
3.按载体来源分 4.按克隆片段得大小 （克隆能力）分
（1）原核载体 （2）真核载体 （3）穿梭载体
病毒载体＋
2、 标记基因的种类
1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子）
主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ， Cmlr，Kanr，Str的生化反 应，如lacZ
3、常用的遗传标记基因及其作用机制
1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr）
Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白 质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编 码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素 分子进入细菌细胞。
2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没 有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质 粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现 象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐 渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和 质粒。
质粒DNA的复制
Ori－复制起始点（origin，ori）
以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性
的（如TcS， lacZα），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作
用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采 用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性 标记基因（lacZ等）。
①拷贝数多，10－200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，当宿主蛋白质合成受 到抑制（如培养中加入氯霉素时）其拷贝数猛增至 1000－ 3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。 ③分子量小，不具备自传递能力。
④基因工程使用松弛型质粒，如含PBMI复制起点的质粒。
2. 标记基因
1、 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可
常用的克隆载体：质粒、噬菌体和病毒。
载体具备的特点
1、 至少有一个复制起点，因 P s t I
而至少可在一种生物体中自
ScaI
Ampr
主复制。
2、 具备合适的酶切位点，以
供外源DNA插入。
3、 至少应有一个遗传标记基
因，以指示载体或重组DNA
分子是否进入宿主细胞。
4、具有较小的分子量和较高
的拷贝数。
分子生物学优秀课件
载体的概念：
1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或 应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体 细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因
进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体
（vector）。 2.将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host
cell）的工具称为vector。 3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，
5、环形双链的质粒 DNA分子具有三种 不同的构型： 共价闭合环状DNA （cccDNA）， 开环DNA（ocDNA）， 线性DNA（cDNA）， 具有不同的电泳迁移率， 可在琼脂糖凝胶电泳中 分开。
质粒的拷贝数与不亲和性
1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数 目。 根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒 分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛 型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因 此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
(1)<1kb (2)<10kb (3)<22kb (4)<50kb (5)0.1-0.4Mb (6)0.5-2Mb
克隆扩增或表达 √√ √
举例 PBR322 PCDN3
PUC8 PBUDCE41 YE
(1)M13 (2)plasmid (3)λphage (4)casmid (5)BAC (6)YAC
（1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。 （2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。 （3）一般情况下，一个质粒只含一个ori，构成一个 独立的复制子。 （4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保 两类细胞中都能扩增。
基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。
复制子 是一段包括复制起始位点，反式因子作用在内的 DNA 片 段 ， 其 功 能 是 通 过 复 制 使 质 粒 能 稳 定 存 在 宿 主 菌 内 （如E.coli）。 松弛复制子的特点
3.BAC 细菌人工染色体。
3.1 质粒载体
1. 质粒的基本特性； 2. 标记基因； 3. 质粒载体种类；
1. 质粒的基本特性
1、质粒(plasmid)是细菌染色体外能够自主复制的
环形双链的DNA分子。
2、质粒的类型： F质粒（性质粒、或F因子）：携带有帮助其自身从 一个细胞转入另一个细胞的信息。 R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性 基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状 （resistance）。 降解质粒：携带有参与或控制一些代谢途径的基因。
2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr）
Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类 的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质 的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨 苄青霉素失活。
3、质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外地游 离状态，但在一定地条件下又会可逆地整合到寄 主染色体上，随着染色体地复制而复制，并通过 细胞分裂传递到后代。
4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核 复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真 核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中 表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。