启动子克隆及活性分析

第6章CpLTP3、CpLTPI.4基因启动子克隆及瞬时表达分析

为了深入探索蜡梅nsLTPs基因家族4个成员CpLTP1、CpLTP2、CpLTP3 、CpLTP4在表达和功能上存在差异的原因，需要进一步克隆各个成员的启动子，以便寻找调控方面的差异。我们利用hiTAIL-PCR法分离得到了CpLTP3、CpLTP4基因的启动子区域，并对调控原件和瞬时表达活性进行了分析，另外两个基因启动子暂时没有得到成功分离，所以没有进行分析。

6.1 实验材料

6.1.1 植物材料

供试蜡梅开花大树品种为罄口蜡梅，种植于西南大学校园内,常规管理。蜡梅小苗通过种子繁殖培育，种子采自西南大学校园罄口蜡梅树。培养条件为湿度85％，16h光照(2000Lx)，温度25℃，8h黑暗，温度20℃。烟草W38（Nicotiana tobacum cv. Wisconsin 38）由本实验室保存扩繁。

6.1.2 菌种和载体

大肠杆菌（Esherichia coli）菌株TOP10，为质粒转化受体菌由本实验室保存。

根癌农杆菌（Agrobacterium tumefacieus）LBA4404，用于农杆菌介导的烟草遗传转化，由本实验室保存。

克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。植物表达载体pBI121，具有Km抗性和完整的GUS基因表达元件，用于构建瞬时表达载体。

6.1.3 主要试剂

Taq DNA聚合酶、各种限制性内切酶、Mgcl2、dNTP、T4 DNA连接酶等购自TaKaRa公司；DL2000、DNA Maker、质粒提取和胶回收试剂盒均购自BioFlux公司；PCR引物合成及DNA测序均由生物工程有限公司合成；氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)和卡拉霉素(Kanamycin,Km)均购自上海生物工程有限公司。

6.1.4 主要设备

紫外分光光度仪（岛津），高速冷冻离心机（HITACHI），台式冷冻离心机（Eppendoff），TGL-16B型台式离心机（上海安亭），Eppendorf PCR仪，IKA型

涡旋器（德国产），高压灭菌锅（日本产），超低温冰箱（sanyo），DYYIII型电泳

仪（北京六一厂），超净工作台（苏州净化设备厂），FR-1型凝胶成像系统（上海复日），722型分光光度计（重庆川仪九厂），恒温振荡摇床，恒温培养箱，水浴锅。

6.1.5 常用溶液配方

氨苄青霉素（Amp）：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL，﹣20℃避光保存。

卡那霉素（Km）：水溶，超滤，贮存浓度50mg/mL，﹣20℃避光保存。

TE（pH8.0）：10mmol/L Tris-Cl（pH8.0），1mmol/L EDTA（pH8.0）。

50×TAE(电泳缓冲液),1L：Tris 242g/L,冰醋酸57.1ml, EDTA(0.5mol/L pH

8.0)100ml/L 。

6×琼脂糖凝胶上样缓冲液：溴酚蓝0.25%（W/V），蔗糖40%（W/V）。6.1.6基本培养基配方

（1）LB培养基（培养大肠杆菌用）

参照3.1.5

（2）YEB培养基（培养农杆菌用）

Trptone 1%（W/V）

Yeast extract 0.1%（W/V）

MgSO4·7H2O 0.5g/L

蔗糖0.5%（W/V）

pH 7.0

(固体培养基加1.5%的琼脂)

（3）烟草转化基本培养基

MS0：MS 基本成分+蔗糖30g/L，pH5.8

MS1(高盐胁迫培养基)：MS0+1mol·L-1 NaCl；pH5.8

MS2(干旱胁迫培养基)：MS0+25%的PEG6000, pH5.8

MS3(脱落酸胁迫培养基)：MS0+100mMABA, pH5.8

MS4(赤霉素胁迫培养基)：MS0+100mMGA3

每种处理3瓶，重复3 次

（5）GUS染液

1）0.5M MES（pH5.6）

9.76g MES(吗啡啉乙磺酸钠)溶解于100ml MQ-water中,调pH5.6

2）固定液(0.3%甲醛，10mM MES pH5.6,0.3M甘露醇)

3）750ul甲醛，2ul 0.5M

MES,5.46g甘露醇，加水至100ml

4）50mM NaPO4 Buffer(pH7.0)

57.7ml 1M Na2HPO4,42.3ml 1M NaH2PO4,加水稀释至2000ml

5）组织化学染色试剂X-Gluc

将10g X-Gluc溶解于100ul的二甲基甲酰胺中，加50mM NaP04(pH7.0)至

10ml

6）70%的乙醇。

6.2 实验方法及操作过程

6.2.1蜡梅基因组DNA的提取、纯化

蜡梅DNA的提取、纯化见3.2.2

6.2.2 hiTAIL-PCR法扩增启动子序列

（1）引物设计

用Liu等人改良的TAIL-PCR: hiTAIL-PCR法扩增蜡梅非特异性脂转移蛋白基

因的启动子[280]。以已克隆到的腊梅CPLTP3和CPLTP4基因5’端序列为基础，分别设计3条特异的巢式引物RB0,RB1,RB2，结合简并引物LAD、及AC0/AC1，分别进行三轮扩增。

LAD1: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVNVNNNGGAA-3′

LAD2: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBNBNNNGGTT-3′

LAD3: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCVVNVNNNCCAC-3′

LAD4: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCCAA-3′

LAD5: 5′-ACGATGGACTCCAGAGCGGCCGCBDNBNNNCGGT-3′

AC0: 5′-GGACGATGGACTCCAG-3′

AC1: 5′-ACGATGGACTCCAGAG-3′

CPLTP3RB0: 5′- GACGCTACCTGCCCACACGTGA TTG -3′

CPLTP3RB1:5′-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCCACGTGAGGAGAGGCCAACAGCAA -3’CPLTP3RB2:5′-CAGCATCAGGCACACAACAACTCCG -3′

CPLTP4RB0: 5′- CCGGTTCTACTTGTTGAA TGGGTGG -3′

CPLTP4RB1:5′-ACGATGGACTCCAGTCCGGCCCTACATGCTGCACCGGCACAGGCGC -3′CPLTP4RB2: 5′-CAGAGTGTTGCGTCGGTGCCATTGC-3′

（2）hiTAIL-PCR过程

以50ng的蜡梅基因组DNA为模板，用3个特异性的巢式引物和简并引物

LAD1-5,AC0，AC1为引物对,进行TAIL-PCR扩增。将预扩增的PCR产物稀释50被

作为第一轮PCR扩增的模板，第一轮PCR。各轮PCR反应体系及反应条件见表6-1。