第5章-蛋白质翻译后修饰

Chapter V
Chapter V
Post‐translational Modification
Of Proteins
One gene more proteins
One gene, more proteins
•蛋白质翻译后修饰（PTM）是指蛋白质在翻译中或翻译后经历的个共价加工过程，即通过1个或几个氨基酸残基加上修饰的一个
基团或通过蛋白质水解剪去基团而改变蛋白质的性质。

•从定义的角度，可以如下理解蛋白质翻译后修饰：
1. 对某氨基酸的修饰包括共价连接简单的官能团（如乙酰基或磷酸基）
1对某一氨基酸的修饰包括
和引入一些复杂结构，如脂类和糖类。

2. 将已经结束翻译的转录本产物切割成成熟的形式，如信号肽或活性肽的
加
工等。

3. 氨基酸的交联，如丝氨酸和酪氨酸。

•可以说，蛋白质组中任一蛋白质都能在翻译时或翻译后进行修饰。

不同类型的修饰都会影响蛋白质的电荷状态、疏水性、构饰不同类型的修饰都会影响蛋白质的
象和（或）稳定性，最终影响其功能。

•诸多实例表明蛋白质的修饰都采取一种可逆模式‐“开”或“关”
的状态行或者调节蛋白质的功能或者作为个真实的分的状态进行，或者调节蛋白质的功能，或者作为一个真实的分子开关。

•目前已发现300多种不同的翻译后修饰，主要形式包括磷酸化、糖基化、乙酰化、泛素化、羧基化、核糖基化以及二硫键的配对等。

等
•加入官能团
乙酰化—通常于蛋白质的N末端加入乙酰。

磷酸化—加入磷酸根至Ser、Tyr、Thr或His。

糖化—将糖基加入Asn、羟离氨酸、Ser或Thr，形成糖蛋白。

烷基化加入如甲基或乙基等烷基。

—
甲基化—烷基化中常见的一种，在Lys、Arg等的侧链氨基上加入甲基。

生物素化—主要有组蛋白的生物素酰化修饰，由羧化全酶合成酶与组蛋白直接相互作用完成，以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化。

以及生物素附加物令赖氨酸残基酰化
谷氨酸化—谷氨酸与导管素及其他蛋白质之间建立共价键。

甘氨酸化—一个至超过40种甘氨酸与导管素的C末端建立共价键。

异戊二烯化—加入如法呢醇及四异戊二烯等异戊二烯。

硫辛酸化—附着硫辛酸的功能性。

磷酸泛酰巯基乙胺基化—像在脂肪酸、聚酮、非核糖体肽链及白氨酸的生物合
聚酮
成中，从乙酰辅酶A加入4‘磷酸泛酰巯基乙胺基。

硫酸化—将硫酸根加入至酪氨酸。

硒化
C末端酰胺化
‐‐‐‐‐‐‐‐
•加入其他蛋白质或肽
—与干扰素激活基因15（ISG15）蛋白质建立共价键。

干扰素激活基因化）蛋白质建立共价键
小泛素相关修饰化—与小泛素相关修饰子蛋白建立共价键。

泛素化—与泛素建立共价键。

•改变氨基酸的化学性质
瓜氨化—将精氨酸转为瓜氨酸。

脱氨化—将谷氨酰胺转为谷氨酸或将天冬酰胺转为天冬氨酸。

•结构改变
双硫键与两个半胱氨酸的氨基酸建立共价键
—与两个半胱氨酸的氨基酸建立共价键。

分解蛋白质—将蛋白质的肽键剪开。

表I：常见的翻译后修饰类型及相应的发生修饰的氨基酸残基（功能反
应基团）
序号氨基酸残基（功能反应团）翻译后修饰反应类型
1Serine/threonine(‐OH)磷酸化修饰
2Cysteine(‐SH)硫醇化、甲基化或氧化修饰
3Lysine(ε‐NH2)乙酰化、生物素化或羟基化
修饰
4N‐terminal of proteins(-α‐NH2)谷氨酰基化修饰
5Glutamine(‐CONH2)去氨基化修饰
6Tyrosine(‐OH)硝化反应、硫酸盐化反应或
磷酸化反应修饰
通过氧化反应产生的亚氧硫7Methionine(‐SCH2)
基修饰
8Try ptophan(吲哚环)氧化修饰
9Proline羟基化修饰
10Asparagine羟基化修饰或糖基化修饰
11Peptide‐Lys/Arg‐Lys/Arg‐peptide蛋白酶水解或剪切作用
12Peptide‐Gly C末端-α‐氨基化修饰
表II: 一些常见的翻译时和翻译后修饰的序列基序。

斜体氨基酸是可以被
修饰的位点
修饰氨基酸残基（功能反应团）翻译后修饰反应类型
磷酸化Aaa‐Aaa‐X‐Aaa‐Tyr Tyr激酶识别位点
‐Ser/Thr‐Neg‐Neg‐Neg II识别位点
X S/Th N N N酪蛋白激酶
Lys/Arg‐X‐X‐Ser/Thr‐X‐X‐X‐Lys/Arg蛋白激酶C识别位点
X‐Ser/Thr‐Pro‐X或Ser/Thr‐Pro‐X P45酪蛋白激酶识别位点
糖基化Asn‐X‐Ser/Thr/Cys(X≠P)天冬酰胺的N‐连接糖基化
羟化Gly‐X‐Pro‐Gly‐X Pro的羟化受X影响
M h L M
N‐甲基化N‐MethyL Met‐X‐X‐P‐X大肠杆菌中的甲基化
羧甲基化Glu‐Glu‐X‐X‐Aaa‐Ser/Thr Glu的羧甲基化
磺酸化Neg‐Neg‐Tyr‐Neg‐Neg Tyr‐SO4常见于带负电氨基酸簇中N‐肉豆蔻酰化Gly‐X‐X‐X‐Ser/Thr肉豆蔻酰化与Gly连接
异戊二烯基化,法呢Cys‐Aaa‐Aaa‐X‐COOH Cys在Cys‐Aaa‐Aaa‐X盒中，多见于基化,香叶基化Ras蛋白
R
信号肽位点Aaa‐X‐Baa‐↓X N端信号肽的切割
Aaa是任意脂肪族残基（Ile、Leu、Val，也可以是Ala）,X是任意氨基酸，Neg是Asp *Aaa X
或Glu，Baa是Ala或Gly或Ser。

修饰发生在哪？( Where does PTM take place )表III 通过亚细胞定位的蛋白质修饰区域化
区室亚区室修饰类型
细胞内细胞核(nucleus)乙酰化（组蛋白ε‐NH
2乙酰化），磷酸化，小
泛素化，O‐连接的N‐乙酰葡萄糖胺化线粒体(mitochondria)N‐甲酰化
叶绿体(chloroplast)N‐甲酰化
高尔基体(golgi body)N‐连接寡糖和O‐连接寡糖，磺酸化，棕榈酸化
内质网(endoplasmic reticulum)N‐连接寡糖，GPI‐锚
核糖体(ribosome)棕榈酸化
溶酶体(lysosome)甘露糖‐6‐磷酸标记的N‐连接糖链
细胞质(cytoplasm)乙酰化，甲基化，磷酸化，O‐连接的N‐乙酰葡
萄糖胺化，小泛素化
细胞表面细胞膜(cytomembrane)N‐连接糖基化和O‐连接糖基化，GPI‐锚
细胞外胞外流体(extracellular fluid)N‐连接糖基化和O‐连接糖基化，乙酰化，磷酸
化
胞外基质(extracellular matrix)羟化，磷酸化，N‐连接糖基化和O‐连接糖基
化
Cellular Post‐translational Modifications
•蛋白质翻译后修饰的鉴定难度要远高于蛋白质的鉴定‐发生翻译后修饰的蛋白质样本量相对较少；
‐发生修饰时形成的共价键很不稳定，且处于动态变化中；
‐修饰与未修饰蛋白质或多种修饰形式的蛋白质常合存混在。

常合存混在
•蛋白质异构体（Isoforms)分离
‐许多翻译后修饰蛋白质都有大量异构体，并且可能带有不同数目的一种或多种
并且可能带有不同数目的种或多种修饰类型。

如糖基化修饰，产生的N‐O‐连接糖链在本质上是不同的。

如糖基化修饰产的连接糖链和连接糖链在本质是不同的
磷酸化、磺酸化或羧基化修饰可直接在蛋白质上引入新的负电荷，导致产生多个蛋白质异构体。

用于蛋白质鉴定的技术‐目前分离蛋白质异构体最有效的方法是2‐D DIGE。

用于蛋白质鉴定的MS技术，包括PMF和基于“鸟枪法”的蛋白质组学策略，由于分析的是肽而非蛋白质，并不适合蛋白质异构体的分离。

•共翻译和翻译后修饰的检测
‐2‐D DIGE分离后的第一步就是要鉴定出哪些蛋白质点带有感兴趣的修饰。

分离后的第步就是要
‐使用不同特异性染料来鉴定疾病、发育或其它细胞过程发生的翻译后修饰变化。

例如荧光染料
例如，荧光染料ProQ emerald –特异性标记2‐D凝胶上的糖蛋白（Steinberg et al, 2001)；
Q特异性检测存多种氨酸磷酸化团并
ProQ diamond‐特异性检测存在于多种氨基酸上的磷酸化基团，并与MS兼容(Schulenberg et al., 2004)。

二者与SYPRO ruby发射波长不同，双染色后可一次用两个波长扫描。

‐蛋白质印记与多种检测器方法结合直接检测蛋白质的特定修饰。

例如，磷酸化肽有高度的免疫原性，目前已有大量抗磷酸化氨基酸的抗体。

像抗Tyr抗体已很普遍，而大多数针对磷酸化Ser和Thr的抗体都具有序列特异抗体已很普遍而大多数针对磷酸化
性（Coba et al., 2003）。

对于糖基化，凝聚素可特异性地检测某类聚糖或单糖，缺点是无法提供聚糖的结构信息。

Fig. 2D-DIGE and phosphostain analysis of mouse hippocampus.
(A)Fragment of a typical 2D-DIGE gel. Cy-3
(green) labels APOE3 and Cy-5 (red)
labels APOE4 TR mouse proteins (Cy-2
(blue, not shown) labels internal control,
composed of equivalent amounts of
APOE3 and APOE4 samples. Spots a, b,
c, and d are mortalin.
(B)Three-dimensional visualization of protein
spots a, b, c, and d, indicated in the
rectangle in panel A.
(C)Phosphostaining of phosphorylated
mortalin. The arrows show mortalin.
Protein isoform b is highly phosphorylated, while protein isoforms a, and c are slightly
stained. Isoform d is not detected with the
Pro-Q phosphostain.
(D)1D Western blot identification of mortalin
expression in APOE3 and APOE4 TR
mouse hippocampi(left two panels).
There are no detectable differences
between APOE3 and APOE4 total
mortalin expression. The right two panels
show identification of mortalin by Western
blot from 2D-gels.
How to Find PTM ?
•蛋白质翻译后修饰的MS分析
‐主要基于氨基酸被修饰后会比修饰前分子质量增加。

根据修饰前后氨基酸质量
根据修饰前后氨基酸的差异，即可精确地预测出修饰基团的质量。

•用于MS翻译后修饰分析的5种常用方法
1. 整个修饰蛋白质分子质量的精确测定。

已有软件能根据修饰和未修饰蛋白质的
分子质量差异来预测可能存在的修饰（Meng et al., 2004)。

2. 利用PMF发现修饰肽段和未修饰肽段的质量差异。

3. 利用肽段的MS/MS碎片发现修饰。

该方法已成为发现修饰蛋白质的主要途径。

4. 在肽段的碎裂过程中检测被特异性修饰“报告离子”。

5. 对于糖基化和脂肪酸类的修饰分析，可先把修饰物从蛋白质或多肽上释放出来，
再进行修饰分析。

修饰析
例如，分析N‐连接糖基化时，通过脱糖基化使被修饰的Asn转化成Asp, 分子质量增加1 Da, 因而能够据此进行位点分析。

释放的寡糖可通过进步断裂进行分析。

Da因而能够据此进行位点分析。

释放的寡糖可通过进一步断裂进行分析。

How to Find PTM ?
‐对于糖基化分析，不同的己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和肌醇都有同样的残基质量（162.058Da）；葡萄糖胺和半乳糖胺也一样（161.069Da）。

这就需要将其它分析技术与聚糖的MS数据结合起来分析。

‐磷酸化和磺酸化修饰业有非常相似的单一同位素残基质量（磷酸化79.663 Da;
磺酸化79.957 Da），可利用高精度MS/MS的碎片将二者区别开来。

Tandem Peptide Spectrum Interpretation
(IM ion)
The Frequency column applies to low-energy collisions in a modern QTOF energy collisions in a modern QTOF
spectrometer
蛋白质特定修饰的分析Analysis Specific Modification Anal sis of Protein
•乙酰化修饰即在蛋白质分子链上嫁接上一个乙酰基分子，是真核生物蛋白质翻译时和翻译后最主要的修饰方式之。

核生物蛋白质翻译时和翻译后最主要的修饰方式之一。

•乙酰化修饰发现于蛋白质的氨基端和Lys的ε‐NH2，因此也称N‐乙酰化，尤其在组蛋白中最为多见。

HATS
www.web‐
•早在四十多年前，科学家就发现了蛋白质“乙酰化修饰”现象，但对其功能认识很局限，主要集中在对细胞染色体结构的影响但对其功能认识很局限主要集中在对
以及对核内转录调控因子的激活方面。

2010
•年2月份的国际权威期刊<<Science>> 发表了我国复旦大学的熊跃、管坤课题组的最新蛋白质“乙酰化修饰”研究成果。

被《Science》评论认为开辟了生命代谢研究的新领域，对深入研究乙酰化修饰具有里程碑意义，有可能改写教科书中关于代谢调控的内容，乙酰化修饰的概念将可能成为代谢调控新内容。

•在人体的肝脏细胞中，人们原先认为只有76个蛋白质具有“乙酰化修饰”现象，通过这项研究，我国科学家发现了有1000个蛋白是被酰化修饰的超过个都是新发现的这发现蛋白是被乙酰化修饰的，超过900个都是新发现的。

这一发现改写了教科书上的传统概念。

对蛋白质乙酰化的新认识
•蛋白质的乙酰化修饰不是少数，极可能影响着细胞生理状态下各个方面的广泛修饰。

•乙酰化修饰普遍存在于人体的代谢酶之中，并且调节代谢通路及代谢酶的活性。

•乙酰化对代谢的调控发生在从低等原核细胞到包括人在内的高等哺乳动物翻译后修饰过程，因此，可以认为这一过程是在生命进化进程中极为保守的。

•蛋白质的乙酰化具有很高的功能特异性—在代谢器官（如肝）中代谢酶被高度乙酰化，而在白血病中参与肿瘤发生的信号通路蛋白也被高度乙酰化。

人们应该针对不同的疾病或不同的组织功能筛查乙酰化修饰蛋白质图谱，从而有可能以不同的蛋白质修饰特性与特点指导有关疾病临床新药的研发，使未来的药物更加能够针对“病灶”、“对症下药”。

鉴于人体80%疾病与代谢有关，《Science》杂志的评论认为：该研究为开发调控代谢的药物提供了新的思路，为包括肿瘤在内的新的治疗手段的发展提供了可能。

为包括肿瘤在内的新的治疗手段的发展提供了可能
乙酰化蛋白的质谱鉴定
•赖氨酸乙酰化的几个重要特征数值：
m/z =126.1的MS/MS特征碎裂峰
被乙酰化的赖氨酸的亚氨离子m/z =143.1, 这一离子丢失一个NH3 后即为m/z =126.1。

研究表明m/z 126.1 检测灵敏度是m/z 143.1的9
倍多，可作为确证赖氨酸乙酰化修饰的依据。

分子式: ＋CH＝CHCH2CH2CH2NHCOCH3
蛋白质乙酰化修饰肽段在其一级MS质谱图中表现为质量数42 Da的增
加。

CH3CO－H＝43－1＝42
在相应的MS/MS图中, 相差一个赖氨酸的相邻b 或y 离子间存在170
Da(赖氨酸乙酰化修饰后赖氨酸分子量)的质量差异。

乙酰化修饰牛血清白蛋白(BSA‐ac)的MS鉴定
Western Blot
1D SDS-PAGE
Zhu et al., 2008
PMF of BSA
PMF of BSA-ac
PMF of BSA
MS/MS spectrum of m/z 1043.67
MS/MS spectrum of m/z104367
PMF of BSA-ac
Zhu et al., 2008
•在生命现象的许多关键调节机制中，蛋白质磷酸化是翻译后修饰中最为广泛的共价修饰形式，同时也是原核生物和真核生物中最重要的调控修饰形式。

•在1950s发现磷酸化酶a和磷酸化酶b原来是同一种酶的磷酸化和去磷酸化形式，从那时开始，人们就开始将蛋白质的磷酸化看作是一种动态的生物调节过程，一直受到生物学家的广泛重视。

•在原核生物中，磷酸化位点主要位于His、Glu和Asp残基，但在真核生物中的磷酸化主要发生在Ser、Thr、Tyr残基上（His和Lys残基也可能被磷酸化）。

•蛋白质磷酸化在真核生物中是非常重要而且是非常普遍的现象，据估计，在任何个给定的时刻，细胞内至少有1/3的蛋白质据估计，在任何一个给定的时刻，细胞内至少
存在磷酸化，其中Ser磷酸化最多、Thr磷酸化次之、Tyr磷酸化最少，三者的比例约为1800:200:1。

据此分析，人类蛋白质组中存在超过10万个的磷酸化位点，目前已经鉴定的只占其中一小部分。

•磷酸化对于蛋白质是非均一性的，大多数磷酸化蛋白质都有多个磷酸化位点，但这并不意味着某个蛋白质分子的所有潜在的磷酸化位点都是磷酸化的。

磷酸化位点都是磷酸化的
•蛋白质的磷酸化则是指由蛋白激酶(protein kinase, PK)催化的把ATP或GTP γ位的磷酸基转移到底物蛋白质的氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶(protein phosphatase, PPase)催化的，称为蛋白质的脱磷酸化。

化的称为蛋白质的
•人类基因组中有2%的基因编码500种激酶和100种磷酸酶，而拟南芥基因组则多达5%的基因编码约1100种激酶和200多种磷酸酶。

蛋白质的
•磷酸化和去磷酸化几乎在每个细胞生物的各个方面都扮演着重要的角色，诸如基因转录、表达，细胞增殖、发育、分化细胞凋细胞间沟通神信号转导免疫肿瘤发分化，细胞凋亡，细胞间沟通，神经信号转导，免疫，肿瘤发生等。

根据被磷酸化的氨基酸残基的不同磷蛋白可大致分为类•根据被磷酸化的氨基酸残基的不同，4：~ O‐磷酸盐‐通过羟氨基酸的磷酸化形成，如Ser、Thr、Tyr。

~ N‐磷酸盐‐通过Arg、Lys或His的磷酸化形成。

g y
~ S‐磷酸盐‐通过Cys磷酸化形成。

~ 酰基磷酸盐–通过Asp或Glu的磷酸化形成。

•目前许多已知的疾病往往由于蛋白质异常磷酸化引起，而有些疾病所导致的后果却是某种蛋白质被磷酸化修饰。

因此，探索
因此探索不同生理状态乃至病理状态下哪些蛋白，哪种类型，以及在哪些位点的磷酸化规律，对于阐述生命本质和疾病发生机制都有显著的意义。

•签于磷酸化在细胞生命活动中发挥的重大作用，磷酸化蛋白质组（phosphoproteome)应运而生，被广泛应用于微生物、植物和动物等方法。

其主要任务之一就是正确解析磷蛋白的结构及其磷酸化位点。

蛋白质磷酸化过程中的质量与结构变化
Ser 和Thr残基磷酸化是不稳定的，在碱性条件下，磷酸基团易脱去，发生β
)
消除作用，再脱去一分子水，分子量减少98Da，(R=H、CH
3
Tyr的磷酸化由于磷酸基团连在苯环上，不会发生β消除，相对较稳定,
磷酸基团脱去后分子量减少80Da
蛋白质磷酸化分析的困难
•尽管现代质谱技术的发展非常迅猛，但是磷酸化分析所面临的难点仍然存在，具体有以下几点：
①磷酸化蛋白质在细胞蛋白质中丰度相对较低；
即使找到一种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的
②即使找到种磷酸化蛋白质，也不能排除有该蛋白质的其他磷酸化
形式存在，在体内磷酸化与其像是一座山（静态），不如像是一条
河（动态）；
③细胞内有许多磷酸酯酶，在进行样品处理时，这些酶很容易将磷酸
基团脱掉，因而加入磷酸酯酶抑制剂是很必要的；
④磷酸化蛋白质酶解后的磷酸化肽段，因为其化学性质的负电性，在
因为其化学性质的在质谱技术中面临着难以质子化的困难；
⑤磷酸化肽段在质谱图中还往往受到非磷酸化肽段信号的强烈抑制，
这一点在MALDI质谱中尤为明显。

磷酸化蛋白质组研究策略
Enrichment of
Phosphoprotein
Ph h t i
Enrichment of
Phosphopeptide
•磷酸化蛋白质抗体
是目前富集磷酸化蛋白质的主要手段，主要分成两种：
①Tyr磷酸化蛋白质的抗体
②Ser磷酸化蛋白质和Thr磷酸化蛋白质的抗体
Western blot /免疫共沉淀
•化学修饰
化学方法进行修饰，改变磷酸基团的化学性质，然后特异性地分采用进行修饰改变然后离纯化，就可以定量分析这些磷酸化蛋白质。

①β消除法
在强碱性条件下磷酸基团发生β消除反应生成双键，再用巯基乙醇通过加成反应取代磷酸基团的位置，然后通过交联剂在巯基上连接生物素，通过亲和分离磷酸化蛋白质或多肽。

通过亲和分离磷酸化蛋白质或多肽
β消除反应后生成的脱磷酸氨基酸直接由质谱检测(MS/MS)。

连接一个生物素的亲和标签，为下一步的亲和纯化和同位素的标记
连接个生物素的亲和标签为下步的
定量(ICAT) 提供条件。

该方法只适合于磷酸化Ser和Thr的取代，而对Tyr的磷酸化无能为力。

由于Cys和Met 也能与生物素反应，因此在β消除反应前首先要对这两
种残基进行强烈氧化（蚁酸），使其丧失活性。

由于O‐糖基化的Ser和Thr也会被该方法衍生，需进一步实验验证蛋白
是否真的被磷酸化。

②碳二亚胺缩合法
碳二酰乙胺浓缩反应，最终在磷酸基团上连接个半胱胺基团通过浓缩反应最终在磷酸基团上连接一个(cysteamine)，修饰的磷酸肽用固相化的碘乙酰凝胶亲和提取，最后使用三氟醋酸洗脱来富集磷酸化蛋白质或肽段。

这种方法适合对各种磷酸化氨基酸的取代
酸的取代。

上述种方法，由于为了避免副反应的影响，都需要对蛋白质的些活上述二种方法，由于为了避免副反应的影响，都需要对蛋白质的一些活性基团进行保护，整个反应体系比较复杂，目前还处于优化阶段。

•强阳离子交换色谱（Strong cation exchange, SCX)
原理：胰蛋白酶切产生的多肽大多带2个正电荷，而1个磷酸基团带1个原胰白酶产生的多电荷
负电荷，所以酶切肽段所带电荷会随着所带磷酸基团的增加减至+1价、0价或者更低价中低价肽段高价肽段早样就磷酸化或者更低价。

在SCX中，比流出时间早，这样就把磷酸化肽段与高电荷非磷酸化肽段分离开。

需对缓冲溶液和梯度进行优化，可用于规模化磷酸化肽段的富集。

•固相金属螯合亲和层析（Immobilized metal affinity y chromatography, IMAC)
在磷酸化蛋白质组研究中应用的抗体只是对磷酸化蛋白质有效，对磷酸化肽段进行富集使用较多是IMAC。

IMAC柱的基本组成:
填料：主要有琼脂糖、硅胶、纤维素和多孔玻璃等。

主要有琼脂糖硅胶纤维素和多孔玻璃等
螯合剂：NTA（次氮基三乙酸）、IDA（亚氨基二乙酸）、TED（三羟甲基乙二胺）等与色谱填料交联成为固定相。

金属离子：常用的金属离子为Fe3+、Ga3+或Cu2+等，被螯合到固定相上。

IMAC柱的工作原理：
磷酸基团与固相化的金属离子通过静电作用吸附，可选择性地亲和提取磷酸化肽段。

在碱性环境下或有磷酸盐存在时，这种相互作用被破坏从而使磷酸化肽段被洗脱。

Ga3+的富集效果要好于Fe3+ ，但大多数实验表明，Fe3+的效果是也可接受的，而且由于Fe3+价格便宜和易于操作的优点，因而，Fe3+比Ga3+的应用更广泛些。

更广泛些
最近，国内尝试Ti4+‐IMAC法，显示具有更好的磷酸肽富集效果。

IMAC柱的主要优缺点:
：快速、直接。

只要可溶、不管磷酸化肽段或蛋白质肽的长度如何优点快速直接只要可溶不管磷酸化肽段或蛋白质肽的长度如何都可被富集，经脱盐处理后可直接用于质谱分析。

缺点：特异性不强。

IMAC技术对Ser、Thr和Tyr的磷酸化都有效，但是IMAC柱上的正电荷位点同样可与肽段中的Asp、Glu和His残基结合，从而对特异性和非特异性肽段同时富集，
弥补：对磷酸化肽段中的酸性残基预先进行甲基酯化，封闭上述氨基酸的酸性侧链，可大大提高IMAC方法的特异性，但酯化过程可能造成其他蛋白质的修饰，因此IMAC法有待改进。

•磷酸基团亲和取代
将磷酸化肽段上的磷酸基团用另一种亲和基团取代(如巯基乙醇和半胱胺基团），再用亲和提取的方法从混合物中分离富集磷酸肽。

•金属氧化物/氢氧化物亲和色谱（Metal oxide/hyroxide affinity chromatography chromatography,
MOAC ）MOAC 用于磷酸化肽的富集可以说是近年来广泛采用的战略，已经取得了令人鼓舞的结果，其中TiO 2是目前使用最广泛的氧化物材料。

TiO 2配体可选择性结合磷酸化的Ser 、Thr 或Tyr 残基的肽段，而与酸性残基的非特异性结合极少，能够从蛋白酶消耗的样品中富集磷酸化肽段，可用于高通量的磁性平台。

如用Thermo Scientific KingFisher 96 和Flex 仪器一次可处理1‐96 各
样品用时分能富集的磷酸化蛋白质灵敏度是传统样品，用时15分，能富集100fmol 的磷酸化蛋白质，灵敏度是传统IMAC 方法的1000倍以上。

富集原理还不完全清楚，实验表明，TiO 与磷酸盐、硼酸盐和硫酸盐均富集原不完清楚实表明2与磷酸硼酸和硫酸均具有高度的亲和力，与磷酸盐的结合能力最高，在调节pH 值后可用于富集磷酸肽。

而能够有效富集单磷酸化肽段，而多磷酸化肽段与TiO 2结合太强难以洗脱。

PNAS February 13, 2007
磷酸化蛋白质/肽段富集策略的优缺点以抗体为基础的对磷酸化蛋白质的富集策略有效但很昂贵，现阶段酪氨酸磷酸化蛋白质的抗体比丝氨酸、苏氨酸的要有效些。

以色谱方法为基础的对磷酸化肽段的富集策略(IMAC/MOAC)，同样有效，在有化学修饰辅助下效果更好，而重要的是试验花费与前者相比微不足道，因而会有更好的应用前景。

与前者相比微不足道因而会有更好的应用前景
磷酸化蛋白质的质谱检测‐MALDI
难题
1.磷酸化肽段是带负电性的，而生物质谱常常用正离子模式，因而它的
1磷酸化肽段是带负电性的而生物质谱常常用正离子模式因而它的
离子化就显得不够。

磷酸化肽段丰度低，且常常和非磷酸化的肽段混合在起，在源
2.磷酸化肽段丰度低，且常常和非磷酸化的肽段混合在一起，在MALDI
的情况下，磷酸化肽段的质谱信号会被非磷酸化肽段的质谱信号抑制。

3.以MADLI为离子源的质谱靶点上的样品几乎同时离子化，所以蛋白质必
离
须先进行分离纯化。

样品的前处理
1.磷酸酯酶处理
一方面，肽段的m/z发生变化。

Ser和Thr磷酸化肽段的质量变化是80 Da，也可能是98Da,Tyr磷酸化肽段只有80Da的质量数变化。

更重要的是，很多磷酸化肽段在脱去磷酸基团后，质谱信号会有很大的提高。