人参皂苷测定及其药理作用的研究概况

人参皂苷测定及其药理作用的研究概况
摘要：人参(P anax g inseng C. A. M eyer) 为五加科人参属植物, 具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺、生津、安神等作用〔1〕。

现代药物学研究证明: 人参皂苷(ginsenoside) 是人参中重要的活性物质, 因此人参皂苷含量的多少评价人参内在质量的重要指标之一。

迄今为止, 人们已从人参各部位(人参根、芦头、茎叶、花、花蕾及参果) 共分离得到20 多种人参皂苷, 可分为20S2原人参二醇(p rotopanaxadiol) 类、20S2原人参三醇(p rotopanaxatriol) 类和齐墩果酸(oleanolic acid)类三类。

对于人参中人参皂苷的含量测定, 国内外研究的都比较多, 常用的测定方法主要有: 高效液相色谱法、薄层扫描法、分光光度法及重量法等。

本文主要讨论这些方法测定的结果, 即不同采收期和不同年限的人参中人参皂苷的含量变化, 以及人参各部位人参皂苷的含量变化等, 以期为综合利用人参资源, 扩大人参药用部位, 合理进行人工种植和炮制提供一定参考。

关键词：人参皂苷人参总皂苷八种主要皂苷含量测定药理作用
1、人参总皂苷的测定
1.1 样品的制备取人参粉（40目）1g，置50ml磨口圆底烧瓶中，精密加入甲醇25ml与沸石少许，摇匀，称重，放置过夜后于水浴中保持微沸回流6小时，添加甲醇至原重离心分离，精密吸取上清液5或10ml（视含量而定），挥去甲醇，将提取物残渣仔细移入1ml容量瓶中，容器用少量甲醇洗涤，洗液合并，精密稀释至刻度。

1.2 总皂苷的测定用微量注射器吸取上述样品溶液10至20μl（视皂苷含量而定），在硅胶薄层上点成线状，用氯仿-甲醇-水（70:55:10）展开，依溶剂达到顶端，将板取出，使溶剂然全挥去，置碘蒸气中数秒，待色点刚显出，立即取出，画出斑点位置，用冷风将碘完全吹尽，用小刀将色点刮入10ml磨口带塞试管中，精密加入5%香荚醛-冰醋酸溶液0.2ml与高氯酸0.8ml，混匀，密塞置60℃水浴中加热15分钟，立即冷却，精密加入冰醋酸5ml，摇匀，离心，取上清液在波长560nm处比色测定，同时取与色点同样大小的空白硅胶加显色剂显色，作为空白对照。

测得的吸收度由人参二醇标准曲线查得相当于人参二醇（A）微克数，由下式计算含量。

生药总皂苷%=A×2.5×100／W
W：点药量相当于生药的微克数
2.5：Rb组皂苷平均分子量与人参二醇分子量之比。

2、八种主要皂苷的测定
2.1 仪器和试药
2.1.1 仪器Agilent 1100系列高效液相色谱仪（美国安捷伦公司），包括G1379A真空脱气机、G1367A自动进样机、G1311A四元泵、G1316A柱温箔和G1315B检测器；KU-DOS-SK2200H超声发射器（上海科导超声仪器公司）；METTLERAE240型十万分之一电子天平（德国梅特勒公司）；DJ-04药材粉碎机（上海淀久公司）
2.1.2药品和试剂人参皂苷对照品Rb1、Rb2、Rb3、Re、Rf、Rg1购自中国药品生物制品鉴定所（纯度＞98.0%），Rc、Rd购自上海融禾医药科技发展有限公司（纯度＞98.0%）。

人参药材购自不同厂家:：上海华宇制药有限公司，批号20071121和20071215；上海德康药店，批号20080104和20080409；上海雷允上大药房，批号20080329和20080517.已腈和甲醇为色谱纯，水为哇哈哈纯净水。

2 .2方法和结果
2.2.1 对照品溶液的制备精密称取人参皂苷对照品Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1，分别为4.70、5.83、2.09、6.26、6.33、5.18、4.80、5.62mg，置于10ml容量瓶中，加甲醇溶液并定容至刻度，摇匀，即得浓度分别为470、583、209、626、633、518、480、562μg／ml的母液。

精密量取上述混合对照品溶液0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01ml，分别置1ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得系列浓度的混合对照品溶液，置于4℃冰箱保存。

2.2.2 人参药材样品溶液制备精密称取人参药材粉末（过三号筛）约1.0g，置具塞锥形瓶中，加甲醇30ml，超声30min，降至室温，补足失重，摇匀，过0.45μm滤膜，取续滤液，即得，置于4℃冰箱保存。

2.3 色谱条件色谱柱：Agilent zorbax SB-C18（
3.0mm×100mm,3.5μm）；流动相为乙腈（A）和水（B），梯度洗脱；A相含量随时间的变化:18%~20%（0~14min）,20%~29%(14~20min),29%(20~25min),29%~37%(25~34min),37%~55 %(34~40min),流速0.6ml/min;检测波长203nm；柱温25℃；进样量10μl。

2.4 方法学考察按出峰顺序，8种人参皂苷Rg1 、Re、Rf 、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd的保留时间分别为：15.713、16.814、2
3.510、28.599、30.030、31.254、31.677、33.292min。

根据对照品溶液的色谱图中8个峰的相关参数计算系统适应性，其理论塔板数分别为11 529、17 002、156 222、89 949、166 291、222 362、236 437、276 995，分离度分别为:2.00、17.75、16.41、
4.23、4.36、1.61、6.28,脱尾因子分别为：1.013、0.958、0.987、0.973、0.979、0.981、0.950、0.985。

空白、对照品以及样品的色谱图见图1.
图1 空白(A)、对照品溶液（B）及人参样品溶液（C）的HPLC/DAD色谱图
1：Rg1 ；2：Re；3：Rf ；4：Rb1；5：Rc；6：Rb2；7：Rb3；8：Rd
2.4.1线性关系分别将“2.2.1”项下制备的不同浓度的系列对照品溶液按
“2.3”项下色谱条件依次连续进样，分别重复3次，以对照品溶液浓度（X,μg/ml）对峰面积（Y）进行线性回归，呈良好的线性关系（表1）。

2. 4.2 精密度试验取“2. 2. 1”项下制备的人参皂苷系列混合对照品溶液中的第1 、4 、6 三个点作为低、中、高三个浓度点,在1 d 以内分别连续进样3 次,以及连续3 d 分别进样,根据所得峰面积分别考察日内精密度和日间精密度。

结果8 种人参皂苷的日内精密度低浓度点RSD %均< 2. 0 % ,中、高浓度点RSD %均< 1. 5 %; 日间精密度低、中浓度点RSD %均< 2. 0 % ,高浓度点RSD %均< 1.
5 % ,表明方法的精密度良好.
2. 4. 3 定量限和检测限考察将人参皂苷对照品溶液进行逐级稀释,以信噪比10 z1 时,确定其最低定量限;以信噪比3 z1 时,确定其最低检测限。

8 种人参皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc 、Rd、Re、Rf 、Rg1 的最低定量限分别为4. 70 、5. 83 、2. 09 、6. 26 、5. 18 、6. 33 、4. 80 、5. 62 μg/ ml ; 最低检测限分别为2. 462 、2. 002 、1. 482 、2. 050 、
3. 129 、2. 369 、1. 083 、
3. 095 μg/ml 。

样品色谱图(图1C) 中,2 号峰Re 和7 号峰Rb3的信噪比分别为:52. 8 :1 和36. 3 :1 .
2. 4. 4 稳定性试验取制备的人参药材样品溶液,分别在0 、2 、4 、6 、8 、12 、24 h 测定8 种人参皂苷的峰面积,考察稳定性。

8 种人参皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc、Rd、Re 、Rf 、Rg1 峰面积RSD %分别为1. 58 %、1. 81 %、1. 52 %、0. 81 %、1. 13 %、1. 47 %、1. 74 %、1. 96 % ,表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2. 4. 5 重复性试验精密称取同一批次人参药材样品5 份,各约1 g ,按“2.
2. 2”项下方法分别制成样品溶液,进样分析。

人参中8 种皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc 、Rd、Re、Rf 、Rg1 的平均含量和RSD %( n = 5) 分别为2. 811 mg/ g (RSD % = 0. 13 %) ,1.366 mg/ g ( RSD % = 1. 70 %) , 0. 715 mg/ g (RSD % =1. 49 %) ,4. 658 mg/ g (RSD % = 1. 44 %) ,
3. 171 mg/ g (RSD %= 0. 33 %) , 2. 652 mg/ g ( RSD % = 0. 92 %) , 0. 338 mg/ g(RSD % = 1. 43 %) ,0. 928 mg/ g (RSD % = 1. 62 %) 。

结果表明本方法的重复性良好。

2. 4. 6 加样回收试验精密称取已知含量的同一批次人参样品1 g 共9 份,每3 份为1 组,按低、中、高3 个水平分别加入对照品一定量(样品中各成分含量的50 %、100 %、150 %) ,按“2. 2. 2”项下制备,进样分析,结果8 种人参皂苷Rb1 、Rb2 、Rb3 、Rc、Rd、Re 、Rf 、Rg1 的回收率和RSD % ( n = 3) 分别为101. 07 % ( RSD % = 1. 07 %) , 98. 72 % ( RSD % = 1. 18 %) ,101. 57 %( RSD % = 1. 01 %) , 101. 71 % ( RSD % = 1. 28 %) ,102. 12 % ( RSD % = 1. 09 %) , 99. 58 % ( RSD % = 0. 93 %) ,98. 62 %(RSD % = 1. 19 %) ,100. 12 %(RSD % = 1. 21 %) 。

结果表明,以本法同时测定8 种人参皂苷的含量回收率结果良好。

2. 5 样品测定按“2. 2. 2”项下方法制备华宇药业、德康药店和雷允上大药房3 个厂家6 个批次的人参药材样品溶液,按“2. 2”项下色谱条件进样分析计算样品含量,结果见表2 。

3.人参皂苷一些药理作用研究
3.1人参总皂甙人参总皂甙( GS , ginsenosides)是从五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 中提取的主要有效部位。

莫志贤等(2) 研究观察到GS 体外对AA、ADP 和胶原诱导的兔血小板聚集有明显的抑制作用,其效应呈剂量依赖性,50 %聚集抑制率IC50依次为0192 ,2110 ,2170mg/ ml ;以肝素凝血酶凝固时间(HTCT) 表示血小板释放反应的程度,结果GS 对血小板释放反应有明显的抑制作用;以TXA2 的稳定代谢产物TXB2 表示TXA2 含量,实验结果表明, GS
1mg/ml 对AA 诱导的TXA2 合成有明显的抑制作用,2mg/ml 对AA、ADP 和胶原诱导的TXA2 合成也有明显的抑制作用;测定游离脂肪酸( FFA) 的含量来表示血小板磷脂酶A2 ( PLA2 ) 活性, 系列浓度( 01125 , 0125 ,015 ,1 ,2mg/ ml) 的GS 可使释放的FFA 量逐渐减少,说明GS 对血小板活性有剂量依赖性抑制作用;按磷酸二酯酶(PDE) 法提取和测定血小板钙调素(CaM) 活性,在Ca2 + 存在下, GS 对CaM 依赖性cAMP2PDE 活性有明显抑制作用, IC50为01039mg/ ml ,进一实验表明,单纯增加PDE 用量或提高CaM 浓度,均只能部分逆转GS(50μg/ ml) 对CaM 依赖性cAMP2PDE 活性的抑制作用,提示GS 对CaM 活性及依赖于CaM 的PDE 活性可能都有抑制作用。

申京建等(3) 同时测定GS 体外和体内对血小板聚集的影响,结果GS 体外可明显抑制AA、ADP 和凝血酶诱导的血小板聚集,抑制强度与剂量相关, IC50依次为0144 ,1120 ,1132mg/ ml ,GS 体内给药对AA 和ADP诱导的血小板聚集也有明显的抑制作用, 给药后2min ,对AA 诱导的聚集几乎完全抑制,对AA 和ADP诱导的聚集随时间的延长而逐渐减弱,在40min 时作用消失;按竞争蛋白结合法测定cAMP ,按放射免疫法测定cGMP ,不同浓度的GS 分别与PRP 温育后,血小板内cAMP 含量有不同程度的增加,此外,PGE1 为腺苷酸环化酶激动剂,茶碱为PDE 抑制剂,两者均可使血小板内cAMP 含量升高,并有协同作用,当GS 与PGE1 合用时对cAMP 的增加作用优于单独的GS 或PGE1 ,表明二者具有协同作用,但GS 与茶碱无协同作用,故推测GS 增加cAMP 作用机理可能与茶碱类似,即抑制了PDE 活性; GS 对血小板内cGMP 无影响。

采用放射薄层扫描等同位素技术(4) ,研究了GS 对血小板AA 代谢的影响,结果表明, GS 明显抑制兔血小板内合成TXA2 和PGA2 ,人参总皂甙0125 ,015 ,110 ,210mg/ ml 对TXA2 和PGA2 生成率与对照组比较差异均有显著性,110 和210mg/ ml 的GS 可使14C2AA 的利用率减少。

推测人参总皂甙抗血小板作用环节可能在环氧化酶,类似于阿司匹林,但也不排除抑制TXA2合成酶的可能性。

3.2 人参皂苷Rb1 心肌肥厚是一种严重的心血管危险因素，能增加其它心血管疾病事件的发生，造成患者死亡或猝[6]。

因此，在治疗原发病的同时使用药物防治心肌肥厚的发生和发展具有重要的临床意义。

在引起心肌肥厚的诸因素中，肾素－血管紧张速系统（RAS）发挥重要的作用[7， 8]，因此我们选用AngⅡ作为促心肌细胞肥大因子用以观察Rbl 对心肌细胞肥大的效应。

结果表明，AngⅡ在10-7mol·L-1 的浓度下能明显增加心肌细胞直径和蛋白含量，而Rbl 呈浓度依赖地抑制上述心肌肥大因子的作用。

实验还表明，在AngⅡ促进心肌细胞直径和蛋白含量增加的同时，作为胚心标志基因的ANF mRNA 表达上调，结果与文献报道基本一致[4,9]。

Rbl 200μg/ml 明显抑制AngⅡ诱导的ANF mRNA 上调，从而进一步证实Rbl 的抗心肌细胞肥大作用。

NO 的抗心肌肥厚作用已为人们广泛关注，我们和其他研究者的实验都表明NO 的前体L-arg 具有良好的抗心肌肥大
效应，且该效应可被NOS 抑制剂L-NAME 完全阻断[10]。

已知人参皂甙可促进NO 的释放，但本研究发现，NOS 抑制剂L-NAME 对Rb1 抗心肌肥大作用无影响，从而提示Rb1 的抗心肌肥大机制可能不是主要通过激活NOS，促进NO 释放所
致。

近年来的研究认为，细胞内钙信号传递途径在心肌肥大的发生发展中发挥重要的作用[11]。

在促进心肌肥大因子的作用下，细胞[Ca2+]i 升高，并与钙调素结合，可启动钙调神经磷酸酶（calcineurin）信号传导通路促进心肌肥大[12]。

从我们的实验结果可见，Rbl呈浓度依赖性地抑制AngⅡ所致细胞[Ca2+]i 升高，也
呈浓度依赖性地抑制该因子所致心肌细胞肥大。

上述事实表明，细胞[Ca2+]i 的升高在AngⅡ所致心肌细胞肥大中发挥重要的作用，而Rbl 的降Ca2+作用与其抗心肌细胞肥大效应密切相关；
综合上述，Rbl 能明显抑制AngⅡ所致心肌细胞肥大，该作用可能与其降低由AngⅡ所升高的心肌细胞[Ca2+]i 有关，而其促进心肌细胞NO 的释放的作用可能不是其抗心肌肥大的主要机制。

3.3人参皂苷Rb3关于局灶脑缺血动物模型已有很多报道[ 5 ] , 目前一致认为选用大鼠具有成本低、种系纯合性好,与人类有类似的脑血管解剖特点等优点, 是最常选用的实验动物。

此外, 大鼠抗感染能力较强, 生命力也强, 实验中动物感染较少, 存活时间相对较长。

关于神经系统体征评分与梗死体积的相关性研究, 国外早有报道。

Bederson认为神经系统体征评分与梗死体积有明显的相关性[ 6, 7 ] 。

本研究结果也证实,神经学评分越高出现梗死灶就越明显。

本研究选用SD大鼠复制MCAO大鼠模型,观察人参皂苷Rb3 对缺血性脑中风的防治作用。

实验结果表明,模型组偏瘫体征典型,脑水肿症状明显,脑梗死面积广泛,表明本实验模型
建立成功。

而人参皂苷Rb3 中、高剂量可改善中动脉栓塞所致局灶性脑缺血大鼠的神经功能,明显缩小梗死面积、减轻脑水肿,显著降低中动脉栓塞大鼠大脑组织中的MDA 含量,增加SOD 含量。

病理切片也表明人参皂苷Rb3 可明显改善局灶性脑缺血时大鼠的脑代谢;维持脑缺血状态下神经细胞的正常形态和功能,延缓、减轻其坏死,表明人参皂苷Rb3对大鼠脑缺血有较明显的保护作用。

缺血性脑损伤的机制研究中[ 8, 9 ] ,兴奋性氨基酸假说、钙超载相关假说和自由基假说之间是相互联系的。

脑缺血时,首先是三磷腺苷耗竭,膜去极化,L2型电压门控钙通道活化, Ca2 +内流,促使谷氨酸大量释放。

后者结合突触后膜受体引起NR过度激活,导致胞内Ca2 +超载,激活包括磷脂酶在内的Ca2 +靶酶,膜磷脂水解,经代谢产生自由基,进一步使质膜和生物大分子破坏,导致缺血灶周边区神经元凋亡。

脑缺血损伤时血小板活化因子合成显著增多,已证实在缺血的神经组织中血小板活化因子水平较正常高20倍,血小板活化因子通过使脑细胞内钙超载,参与一系列炎症反应,在缺血再灌注期产生自由基,使电解质平衡和能量代谢发生障碍,通过脂质过氧化致生物膜裂解导致神经细胞损伤,血脑屏障破坏,并可和其他细胞因子相互作用,加重脑细胞损伤。

此外,血小板活化因子可使脑内兴奋性氨基酸增加,与突触后的N2甲基2D2天冬氨酸受体结合,引起Ca2 +超载,并可致Ca2 +内流,加重脑细胞水肿,加重脑损伤。

血小板活化因子还可引起脑血管收缩,使脑血量减少;能损伤内皮细胞使血管通透性增加,血脑屏障通透性增高;能激活白细胞引起氧自由基及白三烯形成;有很强的促血小板聚集作用等,从而在脑缺血、继发神经元损伤中起重要作用。

本实验重点研究了氧自由基的指标: SOD、MDA的含量。

脑缺血后生成大量氧自由基(OR) 和脂质过氧化物(LP) 是造成神经
元损伤的重要因素[ 10 ] 。

实验结果表明给药组可以明显降低MDA 含量,即降低脑脂质过氧化速率;同时升高SOD的含量,加快对组织超氧阴离子自由基O- 的清除。

综上所述,人参皂苷Rb3 能明显改善MCAO大鼠的神经功能缺损,缩小脑内梗死面积,缓解脑水肿;人参皂苷Rb3 可以通过抗氧化损伤从而保护脑缺血损伤。

本实验结果为人参皂苷Rb3 的进一步研究与应用提供了有力的实验依据和理论支持。

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