南极微生物絮凝剂产生菌的筛选、分子鉴定及适应性研究

南极 微 生物 絮凝剂 产 生菌 的筛选 、 分 子 鉴 定 及 适 应 性 研 究
杜 宁
（ 国家海 洋局 第一海 洋研 究所 海 洋活性物 质重 点 实验 室， 东 青 岛 ２ ６ ６ ） 山 ６ ０ １
摘 要 ： 南极 海 水 、 冰 、 泥 中分 离得 到 ７株 产 絮 凝 剂 的 菌 株 ， 过 １Ｓｒ Ｎ 基 因 序 列 扩 增 方 法 进 行 分 子 鉴 从 海 底 通 ６ Ｒ Ａ
定 ， 别隶 属 于 不 动 杆 茵 属 （ ｉｅ ｂ ｃ ｒ 、 分 Ａｃｎｔ ａｔ ） 节杆 茵属 （ ｔｒｂ ｃ ｒ 、 冷 杆 茵 属 （ ｓｃ ｒｂ ｃ ｒ 、 雷 茵 属 （ ｅｒｔ ） ｏ ｅ Ａｒｈｏａ ｔ ） 嗜 ｅ Ｐ ｙ ｈｏａｔ ） 沙 ｅ Ｓｒａｉ 、 ａ 假 单胞 茵属 （ ｓｕ ｏ ｎ ｓ和 假 交 替 单 胞 茵属 （ ｓ ｄａｔｒｍ ｎ ｓ 。改 变 培 养 基 中碳 源 和 氮 源 的 组 成 并观 察 絮 凝 率 的 Ｐ ｅ ｄ ｍｏａ） Ｐ ｅ ｏ ｌ ｏ ｏ ａ） ｕ ｅ 变化， 筛选 出在 经 济 培 养 基 条 件 下具 有 较 高絮 凝 活 性 、 同时对 碳 源和 氮 源具 有 普适 性 的 菌株 Ｉ ＿ ２和 Ｐ —３１ ２１ —。 关 键 词 ： 生物 絮 凝 剂 ；６ Ｒ 微 １ Ｓｒ ＮＡ； 凝 率 ； 养基 絮 培
２ 结果 与 讨 论
２ １ 菌 株 的 筛 选 ．
属 （ ｓ ｒ６ ｃ ） 沙雷 菌属 （ ｅｒ ｔ ） 假单 胞 菌 属 Ｐ ３ ０口 ｒ 、 ， Ｓ ｒａｉ 、 ａ
（ ｓｕ ｏ ｎ ｓ 和 假 交 替 单 胞 菌 属 （ ｓｕ ｏ ｌ ｒ— Ｐ ｅ ｄ ｍｏａ ） Ｐ ｅｄ ａｔ ｏ ｅ
通 用 发 酵 培 养 基 ： 萄 糖 ２ ， 葡 ０ ｇ ＫＨ。 Ｏ ， Ｐ ２ ｇ
Ｋ２ Ｏ ， Ｃ ． ， ＮＨ４ ２ Ｏ ． ， 素 ＨＰ ４５ ｇ Ｎａ １３ ５ ｇ （ ） Ｓ ４０ ２ ｇ 尿 ０ ５ｇ 酵 母 膏 ．． ， 馏 水 １ ０ ． ， ０ ５ｇ 蒸 ０ ０ｍＬ，Ｈ 值 ６ ８ ｐ ． ～ ７ ２ １ Ｏ℃灭菌 ２ ｎ ． ，２ ０ｍｉ 。
ｓ ｑｕ ｎ ｅ ｏ ａ ｔｒａ ｗｉｈ ｌｃ ｕ ａ ｉｎ ａ ｔｖｔ ｅ ｅ ｃ ｆ７ ｂ ｃ ｅ ｉ ｔ ｆｏ ｃ ｌ ｔｏ ｃｉ ｉｙ
菌株
Ｉ－ １１ 一 ｓ １— Ｏ １
Ｉ２ ．
相似 性 最 高菌 株 （ 录 号 ） 收
Ａｃｎ ｔｂ ｃｅ ｐ Ｎ２ （ Ｑ６ ７ ０ ． ） ｉ ｅｏ ａ ｔｒｓ ． ２ Ｊ ８ ４ ６ １
Ｍｇ １、 ×ｄ Ｃ２ ４ ＮＴＰ混 合 物 各 １０＃ ｌ・Ｌ 。 引 物 各 ０ ｍｏ ＿， １０／ ｌ・Ｌ 。 Ｔ ｑ Ｒ ． ￣ ｍｏ ＿ ， ａ ＮＡ 聚 合 酶 １ Ｕ， 板 Ｒ 模 ＮＡ １ Ｌ Ｃ 反应 条 件 为 ： ４℃ ５ｍｉ ； ４℃ ｌｍｉ， 。Ｐ Ｒ ９ ｎ９ ｎ
因此 ， 作者 以极 地微 生物 为筛 选 目标 ， 拟开 发 出在 经济 培养基 、 低温环 境下 絮凝效 率高 、 量大 的微生物 絮凝 产
剂。
值 ７ 右条件下发 酵培养 ７ｄ 左 。取发酵 液测其 絮凝 率 ，
将具有 良好絮 凝率 的菌 株作 为复筛菌种 。 １ ３ ２ 活性 菌株 的分 子鉴定 ．． 细菌 总 Ｒ ＮＡ 提取 ，６ Ｒ １ Ｓｒ ＮＡ基 因序 列扩增 采用 细菌 １ Ｓ ｒ ＮＡ 基 因 的 通 用 引 物 ， 物 序 列 为 ： ， ６ Ｒ 引 ５＿
ｂ ｃ ｅ ｉ ｎｄ ｔ ｉ ｉ ｉ ｇ ｅ ｉ ｎｍ ｅ ａ ｔ ｒ ａ ａ ｈｅ ｒ ｌｖ ｎ ｎｖ ｒ ｏ ｎｔ
糖 和纤 维 素 等［ １ 。结 合 本实 验 筛 选 到 微生 物 的 生存 环境 来看 ， 正是 由于南极恶劣 的 自然环境 ， 迫使生活 在 其 中的细 菌需要在 胞外分 泌大量 的活性物 质来抵御 环 境 的侵害 ， 而这类 物质 同时也具备 了絮凝 活性 ， 为 以 这
液 的 ０Ｄ。 值 。 。
Ｂｎ ａ ｋ数 据库 已有 菌株 的 １Ｓ ｒ ６ ＲＮＡ 序 列具 有 很 高 的 相似 度 ， 在 ９ 以 上 ； 别 隶 属 于 不 动 杆 菌 属 均 ９ 分
（ ｉｅｏａ ｔｒ 、 杆 菌 属 （ ｔｒｂ ｃｅ） 嗜 冷 杆 菌 Ａｃｎ ｔ ｃ ） 节 ｂ ｅ Ａｒｈ ｏａ ｔｒ 、
从海水 、 冰 和 底 泥 中共 分 离 、 化 得 到 ５ 海 纯 ６株 菌
ｍｏ ａ） ｎ ｓ 。表明筛选 到 的南极 活 性 细菌 没 有专 属性 ， 这 与 目前 已报 道 的产 絮 凝 剂微 生 物 种 类 多 达 几 十 种 以
上［ 相 吻合 。 １ 叼 ， 从 现有研 究来 看 ， 微生物 絮凝剂 为多糖 蛋 白、 多 粘
株， 经初 筛得到有 絮凝 活性的菌株 １ ， 经复筛和传 ８株 再 代 培养 ， 到 ７株具有稳定高絮凝活性菌株 ， 得 见表 １ 。
表 １
Ｔａ ．１ ｂ
产微 生物 絮凝 剂 菌 株 筛 选 结 果 及 其 生存 环 境
Ｔｈ ｃ ｅ ｎｉ ｅｕｌ ｆｍ ｉｒ ｂａｌｆｏ ｃ ｌｎｔｐ ｏ ｃｎｇ ｅ ｓ ｒ ｅ ｎｇ ｒ ｓ ｔｏ ｃ ｏ ｉ ｉｃ ｕ ａ南极 微 生物 絮 凝 剂 产 生 菌 的 筛选 、 子鉴 定及 适 应 性 研 究／ ０ ２年 囊 ９霸 分 ２１
性菌株 絮凝率 的变 化 ， 考察 其 碳 、 源适 应 性 ， 选 出 氮 筛 在经济 培养基 条件 下具有 较高絮 凝活性 的菌株 。 １ ３ ４ 絮凝 率测定 ．． 向 １０ｍＬ烧杯 中加人 ０ ２ｇ高岭 土 、 ０ ． １ｍＬ絮凝 剂样 品（ 微生 物发 酵 液 ） １ｍＬ １ｇ・ 一 的 Ｃ Ｃ ｚ 、 ｍＬ １ ａ１ 溶 液， 加蒸 馏 水 至 总 体 积 ５ Ｏ ｍＬ， 节 溶 液 的 ｐ 值 为 调 Ｈ ７ ０ 置 于 磁 力 搅 拌 机 上 首 先 ２ ０ ｒ・ｍｉ 下 快 搅 ．， ０ ｎ
２１，ｏ２ ｏ ０ ＶＩ ９ ． ２ ． Ｎ ９亿 与 生 物 互 程
Ｃｈ ｍ ｉｔｙ ＆ Ｂｉ ｅ ｇｉｅ ｉｇ ｅ ｓｒ ｏ ｎ ｎ ｅｒ ｎ
ｄ ｉ １ ． ９ ９ ｊ ｉｓ ． ６ ２ ５ ２ ． ０ ２ ０ ． ０ ｏ ： ０ ３ ６ ／．ｓ ｎ １ ７ — ４ ５ ２ １ ． ９ ０ ９
全 的水 处理 剂 卜 ， 成 分一 般 为糖 蛋 白、 其 多糖 、 白 蛋 质 、 维素和 Ｄ 纤 ＮＡ 等嘲 。研究 表 明 ， 地微 生 物较 常 极
温 微 生 物 的胞 外 分 泌 物 分 子 量 更 大 、 分 更 复 杂 ［ 。 成 ６ 卅］
１３ ．
方 法
１ ３ １ 絮凝剂 产生菌 的分离和 筛选 ． ． 分 别取海 水 、 海冰 和底泥 ， 在蛋 白胨 固体 培养基 上 采用平 板划线 法分离并 纯化 以获得纯 菌种 。将分 离到 的菌种 置于液 体培养基 中 ， ５℃ 、２ ・ｍｉ＿ 、 Ｈ 于 １０ ｒ ｎ 。ｐ
１ｍｉ， 后 ８ ｎ然 ０ｒ・ｍｉ 下慢 搅 ４ｍｉ 。静 沉 ２ｍｉ ， ｎ ｎ ｎ
表２
Ｔａ ２ ｂ．
７株 絮 凝 活 性 菌株 １ Ｓｒ Ｎ 序 列 同 源 性 比较 ６ Ａ Ｒ
Ｈｏ ｏ ｏ ｙ ｃ ｍ ｐ ｒｓ ｎ ｆ１ ＲＮＡ ｍ ｌｇ ｏ ａ ｉｏ ｏ ６Ｓ ｒ
中 图分 类 号 ： ３ ． Ｑ ９ ９３ 文献标识码 ： Ａ 文 章 编 号 ：６ ２ ４ ５ ２ １ ） ９ ０ ４ —Ｏ １ ７ —５ ２ （ ０ ２ ０ — ０ Ｏ ３
微 生物絮凝 剂是一 类 由微 生物产 生 的可使水 中的 悬 浮颗 粒 、 菌体 及胶 体粒 子 凝 聚 、 淀 的一类 高 效 、 沉 安
基 金 项 目 ： 家海 洋局 第一 海 洋研 究 所基 本科 研 业 务 费专 项 资金 项 目（０ Ｏ ５ 国 ２ ｌＧ１ ）
收稿 日期 ：０ ２ ５ ２ ２ １ 一Ｏ — ４
作者 简 介 ： 宁 （９ Ｏ ） 男 ， 东济 南 人 ， 士 ， 习研 究 员 ， 要 从 事 极 地 海 洋微 生 物 及 活 性 物 质 的 研 究 ， － ｉ ｄ ｎｎ： ｒ ． 杜 １８一 ， 山 硕 实 主 Ｅ ｍａ ：ｕ ｉｇ ｉ ｌ ＠ ｏ
Ａｒ ｈ ｏ ａ ｔ ｒ ｓ ． ｔ ｒ ｂ ｃ ｅ ｐ ＳＨ一 Ｂ（ ４３ ＦＮ３ ７ １ ． ） ７ ７ ７ １
相 似度 ／
９． ３ ９ ９
１Ｏ Ｏ Ｏ． ０
Ｉ１ ２ 一 —
Ｐｓ ｈ ｏ ａ ｔｒｇｌｃｎ ｏａ（ ｙｃ ｒ ｂ ｃｅ ａ ｉ ｃ ｌ ＡＢ３ ４７ ９ ） ３ ６ ．１
５ ３℃ １ ｒｉ ， ２℃ １５ ｒｉ， ０个 循 环 ； ２ ℃ 延 伸 ｎ７ ａ ． ｎ ３ ａ ７
７ １型可见 分光光 度计 、 ２ 磁力 搅拌 机 、 恒温 振 荡培
养箱 、 高压灭 菌锅 、 Ｃ Ｐ Ｒ扩增仪 、 胶 电泳仪 。 凝
１ ２ 培 养 基 ．
１ ｎ ０ｍｉ 。测序 工作 由 上海 桑 尼生 物 科 技 有 限 公 司 完 成 。将所 测定菌株 的 １ Ｓｒ ＮＡ基 因序 列与 Ｇｅ Ｂ ｎ ６ Ｒ ｎａｋ 数 据库 （ ｔｐ ／ ｗｗｗ ｎ ｂ． ｌ ｎｈ ｇ ｖ ｂａｔｂａｔ ｈｔ ：／ ． ｃ ｉｎｍ． ｉ． ｏ ／ ｌ ／ ｌｓ． ｓ ｃ ｉ进行 相似性 比较分析 。 ｇ） １ ３ ． 活性菌株碳 、 源适应性研 究 ．． ３ 氮 分 别改变通用 发酵 培养基 中的碳源 、 氮源 ， 察活 观
后 改变培 养条件 ， 刺激 活性 菌 株提 高 絮 凝 活性提 供 了
ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣ ＣＴＧＧＣＴＣＡＧ一 和 ５ － ３ ＇ ＧＧＴＴＡＣ—
ｌ 实 验
１ １ 材 料 、 剂 与 仪 器 ． 试
海 水 、 冰和底 泥为作 者在第 ２ 海 ５次南 极科学 考察
中采集 。 ８ Ｏ目过筛高 岭 土。
实验所用 试剂 均为 分析纯 。
Ｃ ＧＴ Ｃ ＴＴ ＴＡ ＧＡＣ － Ｃ 反 应 体 系 总 体 积 为 ＴＴ ３。Ｐ Ｒ ２ Ｌ 包 括： ， １× Ｐ Ｒ 缓 冲 溶 液 、 ． Ｃ １ ６ ｍｍｏ ｌ・Ｌ １ －
Ｐｓｕ ａ ｔｒ ｍｏ ａ ｐ ４ Ｘ（ ｅ ｄｏ ｌｅ ｏ ｎ ｓｓ ． ８ ＥＵ１ ０ ９ ． ） ０ ３ ０ １
９ ．７ ９ ５
９ ．５ ９８
从表 ２可 看 出 ， 所分 离到 的 ７株 活性 菌 株与 Ｇ ｎ ｅ—
式 中 ： 为对 照 上清液 的 ０ 。 ； Ａ Ｄ 值 Ｂ为样 品上 清
１０ ０ ０． ０
Ｐ２ １— —４１
Ｓ ｒ ａｉ ｒｍｅｉ Ｑ３ ＨＭ ２ ７１ ２ １ ｅ ｒ ｔａｇ ｉ ｓｉＤＳ （ １ ２．）
９ ７ ９． ５
Ｐ －４２ ２ １ － Ｐｓｕ ｏ ｎ ｓ ｚｏ ｅｃｎ ＭＧ ８ ０ ＧＵ１ ８ ０ ． ）９ ． ３ ｅ ｄ ｍｏ ａ ｕ ｒｓｅ ｓＬ ｆ ５３（ ９ １ ９ １ ９４
Ｐ３０ — —６ １
Ｐ２ １ — —３１
吸取 上清 液测 定 其 ５ ０ｎ 处 吸光 度 ， ５ ｍ 同时 以蒸 馏 水 代替 发酵 液作 对 照 。以絮 凝 率 （ 表 示 絮凝 活 性 ， Ｅ） 按 下式计 算 ：
Ｅ＝［Ａ—Ｂ ／ ×１０ （ ） Ａ］ ０ ％
Ｓｅｒ ｔ ｐ Ｖ５（ Ｑ３ ５ ０ ． ｒ ａｉ ｓ ． ａ Ｈ ３ ０ ２ １）