黄花倒水莲抗氧化活性研究

黄花倒水莲抗氧化活性研究

黄　锋1,2,林黎琳2,胡娟娟1,刘艾林1,肖培根2,杜冠华13

1中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所国家药物筛选中心,北京100050;2

中国医学科学院中国协和医科大学药用植物研究所,北京100094

【摘　要】　目的:阐明黄花倒水莲(Polygala fallax Hemsl.[P.aureocauda Dumn])的抗氧化活性及有效部位,为进一步的活性追踪及临床应用提供理论依据。方法:从广西采集黄花倒水莲的根部分,经植化手段分离得到

7个化学性质不同的组分(PFE1、PFE2、PFE3、PF B4、PF B5、PF B6、PFW7)。用比色法研究了各组分还原三价铁离子

及清除脂性自由基DPPH 能力,采用化学发光法观察各组分清除羟自由基和超氧阴离子的活性。结果:PFE3、

PF B4对DPPH 、羟自由基、超氧阴离子的清除作用EC 50分别为92144,42129,5150;96133,38126,6121μg ・m L -1。结

论:黄花倒水莲各组分均有一定的清除自由基作用,这可以用来解释其在传统应用中的抗炎、抗衰老作用。

【关键词】　黄花倒水莲,抗氧化,自由基

【中图分类号】　R965 【文献标识码】　A 【文章编号】　167223651(2006)0420291204

【收稿日期】　2005201220

【基金项目】　国家自然科学基金资助项目(N o.3001161940);国家“十五”重大科技专项“创新药物和中药现代化”(NO :

2004AA2Z 3782)

【3

通讯作者】　杜冠华:教授,博导,中国医学科学院中国协和医科大学药物研究所副所长,中国药理学会秘书长,T el :0102

63165184,Fax :010*********,E 2mail :dugh @

黄花倒水莲(Polygala f allax Hemsl.[P.aureo 2cauda Dumn ])又名假黄花远志、黄花参,为远志科远志属植物[1],主要分布于江西、福建、湖南、广东、广西、贵州、云南等地,是广西民间少数民族常用药,以根、茎、叶入药。其味甘、微苦、性平,具补益气血、健脾祛湿、活血化瘀和调经等功效[224],用于治疗病后体虚、腰肌劳损、风湿关节痛、跌打损伤、急慢性肝炎、子宫下垂和月经不调等症[5]。近年来已有一些关于黄花倒水莲化学成分和药理活性的报道[6210],但是对黄花倒水莲的传统应用尚缺乏系统的实验研究。本文在植化分离研究的基础上,对其各种组分进行了抗氧化活性的探索,试图阐明其药理活性及有效部位,为进一步的活性追踪及临床应用提供依据。1　材料与方法111　试　剂

DPPH 、维生素C (Vit C )、NADH 、鲁米诺为美国

Sigma 公司产品,丹酚酸A 由中国医学科学院药物

研究所黎莲娘教授惠赠,其它试剂均为国产分析纯。

112　植化分离

黄花倒水莲(Polygala f allax Hemsl.[P.aure 2

ocauda Dumn ]),2001年10月采自广西,经肖培根研究员鉴定,植物标本存放于中国医学科学院药用植物研究所标本馆,编号为PF200110。

黄花倒水莲根经干燥粉碎后,先用95%EtOH 回流提取2次,每次2h ,过滤,滤液浓缩,得到组分PFE1(含量为生药的7%);残渣继续用50%E 2tOH 提取2次,每次2h ,过滤,滤液浓缩,得到组分PFE2(含量为3%);将PFE1和PFE2两部分合并,

溶于水中,乙酸乙酯萃取3次,乙酸乙酯层浓缩得到组分PFE3(含量为018%);水层继续用正丁醇萃取3次,将正丁醇萃取得到的物质与D101大孔树脂混合装柱,依次用30%EtOH 、50%EtOH 及90%EtOH 洗脱,分别得到PF B4(含量为013%)、PF B5(含量为112%)及PF B6(含量为011%)。萃取后的水层干燥得组分PFW7(含量为619%)。

根据文献[11,12]等报道,黄花倒水莲中主要含有xanthone 、皂苷和寡糖酯等三类成分,采用95%及50%的EtOH 加热提取,能把主要成分提取完全。通过进一步的植化分离,xanthone 类成分主要在PF 2EtOAc 部分富集,皂苷类成分主要在PF 2

BuOH部分富集,糖酯类成分则分布在PF2BuOH和PF2H2O部分。

113　抗氧化活性研究

11311　还原Fe3+能力　待测样品还原能力的测定根据文献方法改进[13]。

以去离子水分别配制2mm ol・L-1的FeCl3和邻菲罗林溶液,于实验前将二者按1∶1体积混合。混合液加入96孔细胞培养板,90μL/孔,然后加入10μL待测样品,使终浓度分别为10μg・m L-1、100μg・m L-1,阳性对照组加入Vit C,空白对照组以去离子水代替待测样品。振荡混匀后于室温下静置30min,用可见/紫外全波长分光光度计测定各孔吸光度值A,测定波长516nm。

11312　清除DPPH能力　DPPH清除实验参考Xu SH等方法并稍作修改[14,15]。精确称量一定量的DPPH,用无水乙醇溶解配成6125×10-4mm ol・L-1浓度的溶液,加入96孔细胞培养板,190μL/孔,加入10μL待测样品,阳性对照组加入Vit E,空白对照组以去离子水代替待测样品。用封板膜封板,室温下避光静置30min。用可见/紫外全波长分光光度计(Z enyth200rt)测定各孔吸光度值A,测定波长517nm。

DPPH清除率(%)=(A空白-A样品)/A空白×100%

A空白:空白对照组光吸收值;A样品:加样品组光吸收值。11313　清除羟自由基　本实验采用Cu2+2H2O22 Vit C体系来产生羟自由基[16218],反应体系中含:邻菲罗林100μm ol・L-1,CuS O450μm ol・L-1,Vit C 100μm ol・L-1,H2O20106%。阳性对照组加入丹酚酸A,空白对照组以去离子水代替待测样品。在加入H2O2启动反应后,立即以T opcount化学发光测定仪测定发光强度值(每分钟脉冲数CPS),测定温度1911℃,每孔计数3秒。按下式计算样品对羟自由基清除率。

羟自由基清除率(%)=(CPS空白-CPS样品)/CPS空白×100% CPS空白:空白对照组化学发光强度值;CPS样品:加样品组化学发光强度值。

11314　清除超氧阴离子　采用鲁米诺增强化学发光法测定NADH2P MS体系生成的超氧阴离子[19221]。实验反应总体积为100μL,内含:NADH73μm ol・L-1,硫酸甲酯吩嗪(phenazine methosulphate PMS)15μm ol・L-1,luminol100μm ol・L-1,硼砂:盐酸缓冲液(0105mm ol・L-1,pH8191)及不同浓度的样品。以011m ol・L-1的NaOH溶液配制011m ol・L-1的鲁米诺储存溶液,检测前用去离子水将其稀释为1×10-4m ol・L-1。将待测样品及各反应试剂加入BMG不透明96孔板,反应由PMS引发,立即测定发光强度CPS值,测定温度1911℃,每孔测定3秒。超氧阴离子的清除率按下式计算:

清除率(%)=(CPS空白-CPS样品)/CPS空白×100%

CPS空白:空白对照组化学发光强度值;CPS样品:加样品组化学发光强度值。

2　结　果

211　还原Fe3+的能力

由表1可知,黄花倒水莲各组分都表示出一定的抗氧化活性,PFE3、PF B4抗氧化活性大于其他组分的活性,但较维生素C的抗氧化活性弱。212　清除DPPH活性

黄花倒水莲各组分对稳定脂性自由基DPPH 具有清除作用。PFE3、PF B4对DPPH的清除作用强于其他组分,但其活性弱于相同浓度的维生素E。结果见表2。

T able1　R eduction activity to Fe3+of seven extracts from root of Polygala fallax H emsl(n=5,x±s)

Extracts10μg・m L-1(OD)100μg・m L-1(OD)

PFE1010662±010*********±010116

PFE2010570±010*********±010255

PFE3010872±01001533014280±01021533

PF B4011012±01004033015346±01037133

PF B5010554±010*********±010131

PF B6010706±010*********±010194

PFW7010534±010*********±010175

Vit C013690±010*********±010060

C ontrol010448±010*********±010078

33P<0101vs control

213　清除羟自由基的活性

黄花倒水莲在phen2Cu2+2H2O22Vc体系中,各组分对羟自由基均有一定清除作用。PFE3、PF B4组分对羟自由基清除活性强于其他组分。但其清除羟自由基活性弱于丹酚酸A。结果见表2。214　清除超氧阴离子活性

黄花倒水莲各组分均对超氧阴离子表现出一定的清除作用。如表2所示,PFE3、PF B4组分对超氧阴离子清除活性强于其他组分,但其清除超氧阴离子活性弱于丹酚酸A。