定量核磁共振波谱法同时测定中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量

DOI :10.11895/j.issn.0253_3820.140654

定量核磁共振波谱法同时测定

中药虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的含量

禹珊1 郭强胜1 王会琳2 高建平2 许旭*1,3

1(上海应用技术学院化学与环境工程学院,上海201418)2

(上海中医药大学中药学院,上海201203)

3(中国科学院天然产物有机合成化学重点实验室,上海200032)摘 要 建立了定量核磁共振波谱法同时测定虎杖中白藜芦醇和虎杖苷的方法㊂样品用80%乙醇和丙酮两次超声提取净化,再用定量核磁共振波谱法测定㊂考察了样品预处理和核磁共振实验条件对测定结果的影响,选择氘代二甲亚砜_重水(10ʒ1,V /V )为溶剂,用基准物质邻苯二甲酸氢钾标定的2,3,5_三碘苯甲酸为内

标,选择脉冲延迟时间为5s,采样次数为32次㊂定量峰为6.388~6.391(白藜芦醇:H_2,6,d,2H)和

6.322~6.330(虎杖苷:H_4,t,1H)㊂结果表明,NMR 测定的精密度均小于0.6%,线性相关系数(r )均大于0.999,白藜芦醇和虎杖苷的检出限分别为0.23和0.24g /L,定量限分别为0.69和1.57g /L,包括样品提取过程的回收率分别为9

7.7%~103.5%(RSD =2.4%)和94.5%~99.2%(RSD =1.6%),显示出定量核磁共振法在中药定量时的可靠性㊂实际测定4种虎杖饮片及配方颗粒样品中白藜芦醇和虎杖苷含量分别为3.57~5.69mg /g 和12.73~24.07mg /g㊂关键词 定量核磁共振;虎杖;白藜芦醇;虎杖苷

2014_08_20收稿;2014_10_05接受本文系中国科学院天然产物有机合成化学重点实验室研究基金资助项目(2013_2014)*E_mail:xuxu3426@

1 引 言

虎杖为蓼科植物虎杖(Poilgonum cuspidatum Sieb.et Zucc )的干燥根茎及根,主要功效为利湿退黄,

清热解毒,散瘀止痛,具有抗菌抗病毒㊁扩张血管㊁抗肿瘤㊁调节代谢等药理作用[1]㊂虎杖作为常用中药已收入中国药典[2],不久也会被收入欧洲药典[3]㊂虎杖含有大黄素和大黄素甲醚等蒽醌类化合物㊁白藜芦醇和虎杖苷(白藜芦醇苷)等二苯乙烯类化合物㊁鞣质和多糖等成分㊂其中,白藜芦醇和虎杖苷是虎杖中两种主要药效成分[1,2](化学结构见图1),这两种成分测定主要以高效液相色谱[2,4]和液相色谱_

图1 白藜芦醇和虎杖苷的结构式Fig.1 Chemical structure of resveratrol and polydatin

质谱联用[5]为主㊂定量核磁共振波谱(Quantitative nuclear magnetic resonance spectroscopy,qNMR)方法简单㊁快捷,实际样品测定时可以不使用待测

组分的对照品[6]㊂已先后被美国药典㊁英国药

典[7]㊁欧洲药典收录,中国药典2010版也已收录[8]㊂近几年来,qNMR 方法已被广泛用于化学药物[9~13]㊁中药与植物提取物[14~19]㊁体液样品[20,21]㊁异构体[22]㊁食品[23,24]等的定量分析㊂本研究在对虎杖样品进行有效提取的基础上,建立了qNMR 定量测定其中白藜芦醇和虎杖苷两种药效成分的方法,考察了实验条件的影响,对所建立的方法进行了验证,并用于实际样品分析㊂2 实验部分

2.1 仪器与试剂Bruker AVANCE III 500MHz 核磁共振谱仪(德国Bruker 公司);M2P 精密天平(精度0.001mg,德第43卷

2015年1月 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第1期69~74

07分析化学第43卷

国Startorius公司);AB204_N天平(精度0.1mg,上海世义精密仪器有限公司);PS_20超声波清洗仪(东莞市洁康超声设备公司);RE_52AA旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)㊂

dDMSO(氘代二甲基亚砜,Dimethyl Sulphoxide_D6,99.9%D)和D2O(重水,Deuterium Oxide, 99.9%D)(Cambridge Isotope Laboratories Inc.);白藜芦醇(南京泽朗医药科技有限公司,批号ZL130705008YY);虎杖苷(南京泽朗医药科技有限公司,批号ZL20120907YY);2,3,5_三碘苯甲酸(Aladdin公司,批号23527);邻苯二甲酸氢钾(基准物质,99.05%~100.05%,国药集团上海化学试剂公司,批号20091218);无水乙醇和丙酮(分析纯,国药集团化学试剂公司)㊂实验用水为某品牌蒸馏水㊂样品1为虎杖中药超微饮片(湖南春光九汇现代中药有限公司,规格:1.2g/袋,批号130439);样品2为虎杖中药配方颗粒(华润三九医药股份有限公司,规格:1g/袋,批号1109001S);样品3为虎杖中药配方颗粒(江阴天江药业有限公司,规格:1g/袋,批号1109081);样品4为虎杖中药饮片(中药原产地:浙江,上海华浦中药饮片有限公司生产,批号:XD13032601)㊂

2.2 实验方法

2.2.1 样品制备虎杖样品研细,准确称取粉末1g,加入30mL乙醇_水(4ʒ1,V/V)摇匀,室温超声30min,抽滤,滤液于55ħ水浴旋干㊂称重后称取部分产物与20mL丙酮混匀,超声30min,抽滤,残渣重复丙酮提取一次,合并滤液,于40ħ水浴上旋干得产物并称重㊂称取适量产物及内标2,3,5_三碘苯甲酸于塑料离心管中,加入0.55mL dDMSO_D2O(10ʒ1,V/V),混合,超声2min,转移至5mm核磁管中待测㊂

2.2.2 核磁共振定量核磁共振(NMR)采集条件:脉冲序列zg30,脉冲宽度14.4μs㊂选择延迟时间5s,扫描次数32次,测定样品的NMR谱图㊂积分时,先将NMR谱图基线调平,选定峰积分区间,每个峰积分3~5次,相对标准偏差(RSD)<1%时取平均值㊂用中国药典2010版中的绝对定量公式计算待测组分的重量[9]:

W s=W rˑ(A s/A r)ˑ(E s/E r)(1)其中W r为内标物的重量,A s和A r分别为供试品特征峰和内标峰的峰面积,E s和E r分别为供试品和内标物的质子当量重量(质量)(以分子量除以特征峰的质子数计算得到),然后根据称样量计算组分在样品中的含量㊂

3 结果与讨论

3.1 样品制备方法的选择

3.1.1 样品提取条件的优化虎杖中有效成分提取方法已有不少研究[25,26],相对传统的醇提法和水提法等,超声辅助提取法更适用于虎杖中热敏性物质白藜芦醇和虎杖苷的提取,提取时间短,提取率高㊂故采用超声提取法㊂

虎杖中的白藜芦醇和虎杖苷在70~80ħ时会发生部分分解,强光照射也会造成部分损失[26,27],常温下稳定性良好㊂故本实验的超声提取在室温进行,无强光照射,提取时间30min,旋蒸温度均在60ħ以内㊂根据文献[25,26],以样品2为研究对象,先用一种溶剂提取,比较了甲醇㊁80%甲醇㊁80%乙醇㊁丙酮㊁以及混合溶剂80%乙醇_丙酮(1ʒ1,V/V)的提取效果㊂结果表明,甲醇㊁80%甲醇㊁80%乙醇以及80%乙醇_丙酮(1ʒ1,V/V)一次提取即可达到提取完全的效果,但测试谱图杂峰较多,影响定量;而丙酮重复提取3次后仍可检测到较高残留,但谱图杂峰较少且不干扰待测组分的定量峰㊂因此考虑两步提取的方式㊂选择80%乙醇做第一步完全提取的溶剂;第二步提取选择丙酮为溶剂净化产物,结果表明,丙酮两次提取即可基本提取完全(第三次提取产物旋蒸后测组分定量峰信噪比仅为17,残留很少,基本不影响定量结果)㊂

实验确定样品提取的条件为:室温,无强光照射,80%乙醇一次超声提取,产物旋干后再经丙酮两次超声提取,时间均为30min㊂

3.1.2 氘代溶剂单独以dDMSO为溶剂时,待测样品图谱中白藜芦醇和虎杖苷的定量峰旁边存在干扰峰㊂尝试dDMSO_D2O混合溶剂,两定量峰可获得较好分离,且没有干扰㊂最终选定氘代溶剂为