发光方法ppt课件

对不同工业类型测试种和复杂性不同 针对工业类型分3个步骤 以过筛方式为主
1 PEEP log [ 1 N (i ) Q ] 10 N N
瑞典：多指标急慢性毒性，可降解性，致突变性，富集性 挪威：多指标急慢性毒性，可降解性，致突变性
加拿大：Microtox, DM, Algae, Ames
美国：全排水毒性控制方案
采样
发光酶
过滤
提取剂
培养
发光
ATP提取
培养
Tanaka等发展的快速微生物测定体系，1997
四种常用的ATP提取体系及优缺点
高氯酸
步骤费时，有干扰，适合野外使用
丁醇/辛醇
加氯仿煮沸 加TRIS缓冲液煮沸
提取速度快，增强荧光，稳定性差
提取速度快，适合大批量样品操作 稀释比较大，灵敏度受影响
利用生物发光方法监测活性污泥生物量
AMP
+ hv
560 nm
水母发光蛋白
蚯蚓发光体系
生物发光体系的应用 无细胞体系 （发光酶）
闪烁记数器
发光细胞体系 （发光菌）
发光酶活性测定 发光酶的核酸探针
定量
LUMINO光度计 电荷偶合成象
实时跟踪
光子影象系统
实时跟踪
典型的无细胞发光测试体系及其应用
直接用细菌发光酶构建的典型发光体系
NADH
FMNH2
RCOOH
黄素单核苷酸还原酶
细菌荧光素酶
NAD
FMN
RCHO
测定相关酶反应程度
测定大肠杆菌含量 105个
测定长链脂肪醛含量 2 ng
直接用萤火虫发光酶构建的典型发光体系
荧光素
AMP
萤火测定不同体系中细菌数 测定系统能量代谢改变
利用生物发光方法分析食品中微生物含量
发光菌的分类(P. Baimann)
属 弧菌 G+C （ %） 45-48 来源 海洋 名称 哈维氏弧菌 I 型美丽弧菌 费氏弧菌 火神弧菌 霍氏弧菌易北变种 明亮发光杆菌 鲋鱼发光杆菌 曼达帕姆发光杆菌 发光异短杆菌
发光杆菌 39-44
非海洋 海洋
异短杆菌 43-44
非海洋
利用发光菌测试毒性时一般操作规程 将4℃保存的斜面菌种转接到新鲜斜面上 22℃培养24h 接种到50 mL液体培养基中 22℃振荡（180r/min）培养16－18h 2000 r/min 离心10分钟 收集菌体并用蒸馏水制成菌悬液 调整菌液浓度 取0.1ml菌悬液加入到0.9ml样品或空白溶液中
重组大肠杆菌
光功率计
苯系物专属型生物传感器
Kobatake, et al., Biosensors & Bioelectronics 1995 ， 10 ( 6-7): 601
Reconstracted Plasmid with Luxgene from V. Qinghainesis Q67 (PACYC L184, 9000 bps, for recombinants of TA98 and TA100)
cml Sall BamH I
2000 8000
Hind III PS II
Hind III
6000
4000
Luxgene (Q67)
朱文杰等., 1999
将发光酶基因标记到具有特殊环境意义的启动子下游
环境应激
（蛋白质结构, DNA损伤, 过氧化氢, 超氧化物，营养缺乏等）
大肠杆菌的启动子
(grpE, dnaK, uspA, lon, lysU, uvrA, recA, xthA, katG, micF, phoA, lac and his)
发光方法
常用的发光方法体系
• • • • 化学发光 发光酶方法 重组发光酶基因的工程菌方法 发光菌方法
化学发光分析中常用的发光体系
鲁米诺发光体系（LUMINOL+H2O2） 过氧草酸盐发光体系
洛粉发光体系（LOPHINE） 光泽精发光体系(LUCIGENIN)
钌(II)-联吡啶配合物发光体系
LUMINOL化学发光体系
发光酶结构基因 (lux genes) 标记细菌细胞
将含发光酶基因的质粒融合到细菌细胞中
例：发光标记荧光假单孢菌研究农用稀土元素对土壤微生物的影响
黄褐土
红壤
菌密度 0
500 稀土元素浓度
1000 0
5 稀土元素浓度
10
安徽农大未发表数据，1999
部分其他环境应用
用发光标记方法跟踪工程菌在环境中的 稳定性和分布特性
Cr(III) SO2 . . .
用LUMINOL化学发光体系构建在线监测传感器 样品
流动相
Lumino
进样器
测量仪
H2O2
蠕动泵
混合管
生物发光体系
发光菌
RCHO
+ +
O2 FMNH2
细菌荧光素酶
RCOOH
+ +
FMN
+ hv
590 nm
萤火虫
O2 ATP
萤火虫荧光素酶
Luciferin
Oxyluciferin
控制标准
不明确
德国：Fish，Microtox，Algae, Ames, DM
爱尔兰：Rainbow Trout
用获得NOEC 的稀释倍数控制
TU1-25，取决于工业类型，每排放1TU需20倍稀释 仅针对典型工业污染评价
荷兰：急慢性毒性，可降解性，致突变性，富集性
英国： Microtox， DM，Oyster, Algae….
采样
稀释
取部分溶液 加入TRIS
加热沸腾 30-60秒
加入荧光素荧光素酶溶液 测量 发光
冷却后加入 TRIS溶液
典型的细胞发光测试体系及其应用
构造带有发光基因的微生物
能够降解苯系物的细菌(Pseudomonas putida)
TOL 质粒
萤火虫发光基因 插入到xylS蛋白启动子位置
融合基因质粒 pTSN316
用标记噬菌体监测宿主细胞种类和密度 根据原生动物/微生物(发光标记)之间的 捕/被食关系研究土壤微生物活性改变
用接种发光标记微生物的方法研究植物 根际动态
用LUX报告基因融合方法研究化学品降 解速率和途径
1995年欧洲部分国家毒性排放控制标准及实施细节 （红色部分是计划1995年以后实施的项目） 法国：DM，Microtox，fish, Ames
电极反应
鲁米诺 + 氧化剂 + 催化剂 + 抑制剂
H2O2 Cu(II) Co(II) Zn(II) Cr(III) Fe(CN)53. . . 胺 醇 磷酯 氨基酸 胆碱 . . .
用LUMINOL化学发光体系测定重金属浓度
体系
对象
Cu(II) Co(II)
鲁米诺 + H2O2 + 隐蔽剂
Zn(II)
TU
i
CMC和CCC
国家环保局生物监测方法规范
GB/T 12990-91
水质: 微生物的PFU测试方法
GB/T 13266-91
水质: 大型蚤急性毒性测试
GB/T 13267-91
水质: 鱼(Pinto)急性毒性测试
GB/T 15441-95
水质: P. phosphoreum (T3) 急性毒性测试