实验 蛋白质的诱导表达

一般融合载体图解
阅读框架的保证
原核表达使用的宿主菌
一般可使用的菌株有： JM109, BL21(DE3), Y1090等。

本实验使用的菌株为：BL21(DE3溶原菌) 噬菌体DE3 : 21抗性区,
LacI基因, LacUV5启动子 T7 RNA聚合酶基因

T7 RNA聚合酶:提高T7启动子启动 的蛋白质的表达水平
典型的表达载体
具备与克隆载体相同的条件：自主复制 序列，可供筛选的遗传性状，MCS 还必须具有用于外源基因表达的启动子、 SD序列、及转录终止子等元件。 pET系列,pGEX系列

原核表达载体的构建
融合蛋白

融合蛋白:
将两个或多个开放阅读框按一定顺序连接, 融合 阅读框表达出一杂合蛋白
这一区段插入了int基因,阻止DE3在有辅助噬菌体的情况下整合到染色体上或从染色体切出,
影响表达效率的主要因素
DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总 称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的 开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达 的调控
1. 转化带有T7RNA 聚合酶基因 的菌株
诱导优化表达目的蛋白
1. 检测质粒稳定性 2. 确定表达时间和温度的最佳条件 3. 分析蛋白溶解性和活性 4. SDS-PAGE, Western 印迹等 确定目的蛋白 1. 放大培养 2. 制备粗提物 3. 亲和纯化 4. 切除融合标签并去除蛋白酶
纯化目的蛋白

稀有密码子:
多数氨基酸都有一个以上的密码子, 但有一些 E.Coli很少 使用, 当异源目的基因的mRNA过表达时, tRNA 的数量直接 反应密码子的偏倚性, 一个或多个tRNA的稀有或缺少会导 致翻译的停止

毒性基因和质粒稳定性:
氨苄青霉素的使用 补充葡萄糖
提高表达水平的措施



提高翻译水平： 调整SD序列与AUG间的距离、点突变改变碱基、增 加mRNA稳定性 减轻细胞的代谢负荷，提高表达水平： 细菌的生长和外源基因的诱导表达分开。 化学诱导，温度诱导。 提高蛋白质稳定性，防止降解。 表达融合蛋白，表达分泌蛋白（防止降解，减轻代 谢负荷、恢复天然构象）
实验
蛋白质的诱导表达
背景知识介绍
基因工程的最终目的：外源基因的高效 表达，获得有重要价值的蛋白质产品 蛋白质的表达是指为获取大量的目标蛋 白而进行的有目的性的蛋白质合成 需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其 他载体，然后导入活细胞。 包括外源基因的克隆、转录、翻译、加 工、分离纯化

诱导表达的实验流程(一)

融合标签:
1. 保护目的蛋白使之不被降解 2. 用于检测和纯化目的蛋白 3. 增加目的蛋白在细胞质中的可溶性 4. 帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提 高其生物活性
常用表达载体
• pJLA50X系列; pcDNAII; etc • pET系列 (T7 promoter, Novagen公司) • pQE系列 (T5 promoter, Qiagen公司) • pMAL系列 (周质表达, BioLabs公司) • pGEX系列 (GST融合表达, Pharmacia公司) • pBAD系列 (Arabinose诱导型) •pTYB系列 (CBD融合, 可以自我切割, BioLabs)
蛋白表达系统操作流程
主要步骤
制备表达载体
操作
1. 酶切, 去磷酸化
2. 胶回收纯化
制备目的DNA 1. 质粒纯化/PCR 2. 酶切 3. 胶回收纯化 将目的DNA 克隆到载体上 1. 目的片断与载体连接
2. 转化非表达型宿主菌
3. 筛选阳性克隆: 菌落PCR, 质粒 提取酶,测序确定阅读框
转化表达宿主菌
pET系统
在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大
目的基因受噬菌体T7强转录及翻译 信号控制 表达由宿主细胞提供的T7 RNA聚合 酶诱导 充分诱导:

几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白, 数小时后 达细胞总蛋白的50%以上

非诱导条件下:
可使目的基因完全处于沉默状态而不转录
原核表达载体转化到BL21(DE3)菌株中。 挑取单菌落于5mL Amp+ LB培养基培养过 夜。 以5%的比例转接于20mL Amp+ LB培养基 中，培养约3小时至OD600=0.6，即可开始 诱导目的蛋白的表达. 取1mL菌液,制样作为未诱导对照 三角瓶中加入IPTG 20uL至终浓度为1mM。 继续培养。

诱导表达的实验流程
取样：分别于培养后，0.5, 1，1.5, 2, 2.5, 3小时
取1mL菌液制样。
制样：

12000rpm离心1min，去掉上清。 加入20uL ddH2O，重悬(充分分散细胞) 加入20uL 2×SDS凝胶加样缓冲液，混匀 沸水浴5min(蛋白质变性)，取出后立即置于冰 上。 冷却后，冰箱冷藏, 备用.
蛋白质的表达
根据宿主细胞性质分为：原核表达
和真核表达,根据最终目标选择相应 的宿主－载体系统

大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、 分子生物学方面已被充分了解而成为表 达异源蛋白质的首选表达系统 遗传图谱明确，容易培养且费用低，生 产成本低廉。
原核表达的特点
细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子 真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译 缺乏转录后加工系统，不能切除内含子, cDNA, 表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破 坏 缺乏翻译后加工体系 不溶性的包强终 止子 等。 影响翻译水平的因素：SD序列， mRNA稳定性等。 影响蛋白质水平的因素：异源蛋白，易 降解
优化表达

增加蛋白质溶解性及折叠:
温度: 37 C 蛋白质以聚集的形式表达--包涵体 30 C 可溶的有活性的蛋白 细胞周质定位: 有利于蛋白折叠及二硫键的形成

诱导原核表达的原理
结构基因：编码-半 乳糖苷酶（Z）、透性 酶（Y）和硫半乳糖苷 乙酰转移酶（A）的基 因。 操纵 子 ： 包 括 启 动 子 、 操纵基因和结构基因 调节基因、阻遏蛋白 乳糖+阻遏蛋白，改变 阻遏蛋白的形状
诱导原核表达的原理
将外源基因克隆在含有lac启动子的表 达载体中，让其在大肠杆菌中表达。lacI 产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从 而不能进行外源基因的转录和表达，此 时宿主菌正常生长。然后向培养基中加 入lac操纵子的诱导物IPTG，阻遏蛋白不 能与操纵基因结合，则外源基因大量转 录并高效表达。