原子力显微镜及其在蛋白质研究方面的应用
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原子力显微镜及其在蛋白质研究方面的应用
生物物理学系 张岚
原子力显微镜(atomic force microscopy ,AFM)由G.Binnig,C.Quate和C.Gerber 于1986年发明,现已成为一种观测细胞和生物大分子形态结构的强有力的工具。AFM具有独特的操作方式,可在中等量级(亚微米)上研究生物系统一般形态结构;可使细胞及生物大分子在生理溶液的条件下成像。AFM对生物系统的成像分析比光学显微镜具有更高的分辨率(其横向分辨率为2-3nm,纵向分辨率为0.5nm)1,比电子显微镜观测所需的样品处理更接近生理条件,比通常需要从大量光谱信号中间接推导结构信息的光谱学技术更直观,且不需要依赖于晶体样品,十分有利于研究天然状态下的生物样品。
一、引言
1982年G.Binnig和H.Rohrer共同研制成功了第一台扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope,STM),使人们首次能够真正实时观察到单个原子在物体表面的排列方式和与表面电子行为有关的物理、化学性质。STM的工作原理是基于量子理论中的隧道效应2,将原子线度的极细探针和被研究样品的表面作为两个电极,当样品的表面与探针针尖的距离非常近时(一般小于1nm),在外加电场作用下,电子会穿过两个电极之间的势垒从一个电极流向另一电极,从而产生隧道效应。STM要求样品表面能够导电,因此只能直接观察导体和半导体的表面结构,对于非导电的物质则要求样品覆盖一层导电薄膜。DNA等生物大分子几乎都为非导体或离子性导体,需要将样品用薄金属层包裹或制作样品的金属复制物来进行成像观测,因此分辨率受到限制,且制备复杂易损坏,现场操作性差,不利于实时跟踪观测研究对象。STM虽然可在石墨等载体上,直接在空气或溶液中观察某些生物大分子样品,但图象分辨率较低,且可重复性差,可能由于扫描过程中探针与样品分子的相互作用而使样品分子发生漂移而经常落在视野之外。
为了克服STM的不足,Binnig、Quate 和Gerber利用微悬臂作为力信号的传播媒介,将其放在样品和STM的针尖之间,于1986年推出了原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)。AFM通过探针与被测样品之间微弱的相互作用力(原子力)获得物质表面形貌的信息。相对于STM,AFM 的生物大分子样品无需覆盖导电金属膜或制作金属复制物3,可以在空气或各种溶剂体系中直接观测,更接近生理环境;并且可通过控制成像操作力的大小,采用合适的成像模式不引起样品分子的漂移和损坏,图像的可重复性大大提高;现场操作性好,能够研究监测整个生化反应的动力学过程;载体的选择更加简单,范围更大,可用云母片、玻璃片及某些生物膜等。
以STM和AFM为基础2,衍生出了一系列的扫描探针显微镜(scanning probe microscope,SPM),有激光力显微镜(LFM)、磁力显微镜(MFM)、扫描电化学显微镜(SECM)、近光光学显微镜(SNOM)、弹道电子发射显微镜(BEEM)、扫描离子电导显微镜(SICM)等。
二、AFM的工作原理
AFM采用对微弱力极敏感的“V”字形微悬臂和针尖作为微探针4,样品固定于扫描器上,反馈控制系统通过扫描器控制样品位置,并控制样品与探针间作用力。当针尖充分逼近样品时,两者间即产生原子力,其中纵向力Fn将推动微悬臂偏转,其大小与针尖——样品间距成一定的对应关系,即与样品表面的起伏具有对应关系。采用光点偏转法可将微悬臂的偏转量放大。一束激光投射到微悬臂的顶端后被反射,反射光束被位置敏感元件(PSD)接收,PSD光敏面上光斑的偏转位移量,比微悬臂的偏转量放大了数千倍,
即起到一种光杠杆的作用。放大后的偏转量可直接由PSD精确测定。见图1。样品扫描时,作用于针尖上的原子力随样品表面的起伏而变化,检测PSD输出光电流的大小,接收信号并经计算机系统采集、处理,即可推知微悬臂偏转量的大小,最终获得样品表面的原子级形貌图像。
图1 AFM的光点偏转法原理图
(摘自张冬仙 黄峰.卧式原子力显微镜的研制.光学仪器,2001,23(2):14-17)
三、AFM的工作模式
当AFM的微悬臂与样品表面原子相互作用时,通常有几种力同时作用于微悬臂,其中最主要的是范德瓦尔斯力。当两个原子相互靠近时,它们将互相吸引,随着原子间距继续减小,两个原子的电子排斥力将开始抵消引力,直到原子的间距为几个埃时,两个力达到平衡,间距更小时,范德瓦尔斯力由负变正(排斥力)。利用此力的性质可使针尖与样品处于不同的间距,由此改变微悬臂与针尖的工作模式。
3.1 接触模式(contact mode)当针尖与样品间的范氏力处在排斥力区时,两者的间距小于0.03nm,基本上紧密接触,故称接触模式。此时针尖原子与样品表面原子的电子云发生重叠,排斥力将平衡几乎所有可能使两个原子接近的力,微悬臂将弯曲而不可能使针尖原子与表面原子靠得更近。微悬臂的弯曲可以较方便地被检测从而使仪器的分辨率极高,达原子级水平。运用接触模式可以测量原子间的近程相互斥力,所测最小力10-9N。也可用来测定针尖与样品间的摩擦力,最小检测极限可达10-10N。
接触模式包括恒力模式(constant force mode)和恒高模式(constant height mode)2。在恒力模式中,利用反馈线圈调节探针与样品表面的距离,以保持微悬臂的偏转程度不变,从而保证样品与针尖之间的作用力恒定。当沿X、Y方向扫描时,记录Z 方向上扫描器的移动情况,得到样品的表面轮廓形貌图像。这种模式通常采用改变样品的上下高度来控制探针与样品表面的距离,得到的样品高度值较准确,适用于物质的表面分析。在恒高模式中,保持样品与针尖的相对高度不变,直接测量出微悬臂的偏转情况,即扫描器在Z方向上的移动情况来获得图像。这种模式对样品高度的变化较为敏感,可实现样品的快速扫描,适用于分子、原子的图像的观察。
由于生物分子的弹性模量较低5,同基
底间的吸附接触也很弱,针尖——样品表面间产生的压缩力和剪切力很容易使样品变形,从而降低图像质量。
4.2 轻敲模式(tapping mode)在此模式中,微悬臂以较大振幅振荡6,约100nm,针尖在振荡的底部均与样品轻轻接触,故称轻敲模式。因为这种接触非常短暂,不易损坏样品表面,且针尖的垂直力远大于水的毛细张力,使针尖可以在表面水层中进出自如,适于对液体环境中柔软、易脆和黏附性较强的样品的成像。又由于针尖与样品有接触,故其分辨率跟接触式的一样好。轻敲模式在高分子聚合物的和生物大分子的结构研究中应用广泛。
在轻敲模式中,通过调制压电陶瓷驱动器使带针尖的微悬臂以某一高频的共振频率和0.01~1nm的振幅在Z方向上共振,而微悬臂的共振频率可通过氟化橡胶减振器来改变。同时反馈系统通过调整样品与针尖间距来控制微悬臂振幅与相位,记录样品的上下移动情况, 即在Z方向上扫描器的移动情况来获得图像。
四、AFM的探针
探针是AFM的核心部件1,直接决定其分辨率。针尖的表现依赖于其形状和尺寸,并与化学组成和表面性质密切相关。传统探针针尖常由单晶硅(Si)和氮化硅(Si3N4)制作,是微悬臂——针尖一体化的结构。针尖为金字塔形,锥角20-30o,硅针尖的曲率半径为5-10nm,氮化硅的曲率半径为20-
60nm。当样品的尺寸大小与探针的尖端曲率半径相当或更小时,会出现所谓的“加宽效应”,即测量值大于真实值,影响图像准确度。为克服“加宽效应”,一方面可发展制造尖端更尖的探针,如用单壁碳纳米管制备的AFM探针,针尖的曲率半径可达0.5-2nm,将会获得更高的分辨率;另一方面对标准探针进行生物或化学修饰也可提高图像质量。
与传统的AFM针尖相比较,碳纳米管针尖有几个显著的优点7。首先,高的纵横比。第二,高的机械柔软性。针尖扫描时,即使撞击到样品的表面也不会使针尖损坏。第三,高的弹性变形。可有效地限制针尖在样品表面上的作用力,从而减少对样品的损害,对柔软的生物样品特别有利。第四,稳定的结构。碳纳米管针尖是圆柱形,且末端总是封闭的,即使在制作针尖时为调整其长度而截掉一段后也是如此。因此,碳纳米管针尖末端总是处于十分稳定的结构。
五、AFM在蛋白质研究方面的应用
AFM可以满足多种不同样品的要求,用于多种系统的成像,例如量子点、生物分子、多聚体以及单体的自组装等。AFM可实现在纳米尺度上的成像、控制和分子间相互作用力的测量。用AFM对蛋白质分子成像不仅能在分子水平上了解其形态,而且可以在成像基础上,对大分子的其他性质进行研究,如抗原-抗体识别、蛋白聚合、纤维组装、生物膜的亲疏水性等。
5.1 蛋白质构象观察 得到物理吸附于支持物表面的独立蛋白的高分辨率成像是AFM最具挑战性的任务之一。San Paulo 和García利用AFM观察了抗体分子8(抗人血清白蛋白IgG),抗体分子(-150kD)由两个包含抗原结合位点的Fab段和一个Fc 段构成,三级结构为“T”或“Y”形状(图2)。图3为HAS分子的AFM成像,显示分子的四种基本形态,图4为每种形态的高分辨率图像。图4(a)显示抗体分子的Fab段,Fc段突出于表面外;(b)可能代表相反的情况,显示抗体分子的Fc段,Fab臂突出于表面外;(c)为抗体分子的一个Fab臂和Fc 段沉积于支持物表面,另一个Fab臂则突出于表面外;(d)显示三个片段都平铺在支持物表面。不同的形态可能是对云母片的非特异吸附造成的。在每种形态中,分子间侧向和垂直方向的分辨率有微小的变化,可能与连接Fab段和Fc段的铰链区的屈曲有关。