高效液相色谱法简介

几个概念
色谱柱：进行色谱分离用的细长管。
固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。 流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。
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§1-4
高效液相色谱法的特点
一
高压
液相色谱以液体作为流动相（称为载液）， 液体流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能 迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在 现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高， 一般可达到 150 ～ 300kg ／ cm2 ，甚至可达 700k ／cm2以上。
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§5-2
定量分析
HPLC色谱定量的基本方法有内标 法、外标法等。 外标法———标准曲线法 是一种简便、快速的 绝对 定量方 法（归一化法则是 相对 定量方法）。 首先用欲测组分的标准样品绘制标 准工作曲线。
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具体作法是：
用标准样品配制成不同浓度的标 准系列，在与欲测组分相同的色谱条 件下，等体积准确量进样，测量各峰 的峰面积或峰高，用峰面积或峰高对 样品浓度绘制标准工作曲线，此标准 工作曲线应是通过原点的直线。若标 准工作曲线不通过原点，说明测定方 法存在系统误差。标准工作曲线的斜 率即为绝对校正因子。
式中：
﹙ 2﹚
Wt1/2 -------------半峰宽
例如，从图 2-3 ，测得 tR=105mm 、 Wt1/2 =4mm ， 求得 N=3789 ，若此柱长为 250mm, 折成每米的理论 塔板数约为15200.
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§2-3
分离度及影响因素
一 分离度（分辨率)
研究色谱中有关分离问题时，首先就 是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。 从图 8-3 可以看出，为了获得较好的分 离，就必须使最大峰值之间的距离增加， 峰宽减小。
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高效液相色谱， 特别适用于分离沸点 高和热稳定性差的物 质，目前已广泛用于 化工、食品、医药、 生化、卫生、环境保 护和高能化合物等生 产和科研工作中。
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紫杉醇的分析
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农药的分析
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样 品 吸 收 度 测 定 — 吸 收 池 示 图
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紫外检测器工作原理
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定量环进样
装样
（ＬＯＡＤ）
开始分析
进样阀
淋洗液
（ＩＮＪＥＣＴ）
淋洗液
废液 废液 样品
样品
至分离柱 样品 环
至分离柱
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液相色谱动画演示
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二、色谱图（chromatogram）
试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序 经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度 变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的 信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线， 称为色谱流出曲线，或色的柱色谱
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三组分混合物的分离
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在C18柱中，三组分混合物流出色谱 柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。
当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流 动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分 子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中 存在的浓度也各不相同。固定相中存在量多的化合 物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配 系数有关：
1. 基线 : 在操作条件下，仅有纯流动相进入 检测器时的流出曲线。
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2. 色谱峰: 当组分随流动相进入检测 器时，其响应信号大小随时间变化所形 成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分 布。
3.峰高与峰面积
峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距 离称为峰高(peak height)。用h表示。 峰面积：峰与峰底之间的面积称为峰面 积(peak area)，用A表示。
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二 高速
高效液相色谱所需的分析时间较之经 典液体色谱快得多，一般可达l—10mL／ min， 个别可高达100mL／min以上，这 已近似于气相色谱的流速。
三 高效
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高，一般约可达 60000理 论塔板／米；
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四 高灵敏度
紫外检测器的最小检测量可达毫微克 数量级 (10-9 g) ；荧光检测器的灵敏度可达 10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在 所需试样很少；微升数量级的样品就足以 进行全分析。
H=L/n 式中n为理论塔板数。
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色谱柱的分离效率（简称柱效）， 可定量地用理论塔板数N来表示。 理论塔板数一N还与柱长有关，当 比较两不同长度的色谱柱的柱效时， 应当比较它们在相同柱长下的V值。
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可用半峰高处的峰宽 ( 半峰宽）和保留时间 的关系来表示理论塔板数N，这时关系式为： N＝5．54 ( tR / Wt1/2 ) 2
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§ 2－ 1
一、保留时间（tR）
保留值
从进样开始到柱后出现样品的浓度极大 值所需的时间为保留时间，用tR表示。
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§2-2 色谱柱的分离效率及柱效能的评价 一、塔板理论
塔板理论认为，一根柱子可以分为n段， 在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每 一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔 板高度为H，则
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§1-5 高效液相色谱流程和设备
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系 统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动 进样及数据处理等。其工作过程如下： 首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进 样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。 当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的 流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后 依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出 的信号记录下来，由此得到液相色谱图。
K
= 化合物在固定相中的浓度C固
化合物在流动相中的浓度C流
K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后 流出柱子。
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键合相-反相色谱
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§1. 概 述 ： 色谱法：(chromatography)
以试样组分在固定相和流动相间的溶解、 吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差 异为依据而建立起来的各种分离分析方法称 色谱法。
主讲：郑萍 高级工程师， 执业药师
化学化工学院
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液相色谱分析是在经典的液体柱色 谱基础上，引入了气相色谱的理论；在 技术上采用了高压泵、高效固定相和高 灵敏度检测器，实现了分析速度快、分 离效率高和操作自动化，这种柱色谱技 术被称做高效液相色谱法。
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色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
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一般用 Rs 来定量表达相邻两峰的分离 程度，所以Rs是色谱中两个组分分离好坏 程度的标志。要求RS>1.5
tR1 －tR2 Rs = ———————— 1/2(W1+W2)
式中 tR1、tR2 分别为两组分的保留时间， W1 、W2为色谱峰的峰底宽度 .
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§5 高效液相色谱的定性和定量分析
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目前已普及于几乎所有重要的分析学科 领域和许多科研生产部门，高效液相色谱能 较理想地分离和分析与生物医学有关的大分 子和离子型物质，易变质的天然产物，各种 高分子化合物和不稳定化合物。
例如：蛋白质、核酸、氨基酸、多糖、颜
料极性类脂肪化合物、药物、染料、表面 活性剂、农药、甾族化合物、多环芳烃、 合成聚合物、瞟吟、维生素、除锈剂、防 老剂等等。
§5-1
定性分析
在液相色谱中保留值定性的方法主要是用 直接与已知标准物对照的方法。当未知峰的 保留值（t R′或V R ′ ）与某一已知标准 物完全相同时，则未知峰可能与此已知标准 物是同一物质，特别是在改变色谱柱或改变 洗脱液的组成时，未知峰的保留值与已知标 准物的保留值仍能完全相同，则可以基本上 认定未知峰与标准物是同一物质。