亲和色谱技术在天然药物研究中的应用_陈芳有

Applications of Affinity Chromatography in Natural Medicine Ｒesearch
CHEN Fang-you，LUO Yong-ming* ，WU Yang-ming，JIANG Chen-xing，ZHANG Xue-lian （ Pharmacy School of Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine，Nanchang 330004，China）
CMC 作为生命科学与色谱分离技术交叉形成的一种极 具发展潜力的新兴色谱技术，是将活性组织细胞膜固定在特 定载体表面，制备成细胞膜固定相，以缓冲溶液为流动相，药 物为溶质添加在流动相中，利用色谱学技术研究药物与固定 相之间作用规律的受体动力学新方法。该方法将药物效应 成分的分离和活性筛选结合在一起，克服了先从中药中分离
［关键词］ 亲和色谱； 天然药物研究； 生物分子 ［中图分类号］ Ｒ284． 1 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903（ 2014） 11-0230-05
［doi］ 10． 13422 / j． cnki． syfjx． 2014110230
［网络出版地址］ http： / / www． cnki． net / kcms / detail /11． 3495． Ｒ． 20140324． 1547． 010． html ［网络出版时间］ 2014-03-24 15： 47
［Abstract］ Affinity chromatography is a method using the specific affinity adsorption between biological molecules and surface-ligand of affinity chromatography stationary phase for selective separation of biomolecules． It has been widely used for separation，detection or study among the target molecules of complex samples with the advantages of high selective，high recovery efficiency and high purity． Affinity chromatography has become a very important method in natural medicine research gradually． The commonly used categories consist of immunoaffinity chromatography， lectin affinity chromatography， cell membrane chromatography， immobilized metal affinity chromatography，molecular imprinting，dye ligands affinity chromatography，aptamer affinity chromatography， affinity membrane chromatography and frontal affinity chromatography． The applications in natural medicine research of the main categories of affinity chromatography，the types and the preparations and choice methods of ligands are introduced in this review，and its application is prospected as well．
陈芳有，等： 亲和色谱技术在天然药物研究中的应用
柱，因此在亲和色谱分析中，提高色谱分离的选择性，可通过 变换不同分离机制的色谱柱而容易解决。该方法将天然药 物效应成分的分离和活性筛选结合在一起，特别适合于中药 及天然药物物质基础研究。本文对常用的几种亲和色谱技 术及其在天然药物研究领域的应用进行了综述。 1 亲和色谱技术的分类 1. 1 免 疫 亲 和 色 谱 免 疫 亲 和 色 谱 （ immunoaffinity chromatography，IAC） 是一种高效、简便的样品前处理技术。 IAC 是将抗体偶联到固相载体而制成免疫亲和色谱柱，根据 待测物与抗体之间有选择性的和可逆的相互作用从而将分 析物从复杂的样品基质中分离出来。IAC 是基于免疫反应 的基本原理，利用色谱的差速迁移理论，实现样本的分离和 分析的一 种 方 法［4-5］。首 先，将 特 异 性 的 抗 体 固 定 在 担 体 上，制成免疫亲和担体，然后填入柱中； 分析时，样品中的 待测组分与吸附剂上的抗体发生抗原-抗体结合反应而被保 留在柱上，其他成分则直接被洗脱； 随后，再使用适当的洗 脱溶剂将待测 组 分 洗 脱 下 来，进 行 下 一 步 的 分 析。 该 方 法 可以大大简化提取、净化、衍生化等复杂的前处理过程。 1. 2 凝 集 素 亲 和 色 谱 凝 集 素 亲 和 色 谱 （ lectin affinity chromatography，LAC） 以偶联了凝集素的基质为固定相，它们 能识别不同 的 糖 基，广 泛 用 于 分 离 和 鉴 定 糖 蛋 白、糖 肽、糖 脂、寡糖。凝集素（ lectin） 是从植物（ 菜豆、大豆、扁豆、花生、 蓖麻、小麦胚等） 中提取的糖蛋白被认为是阐明糖“密码”的 蛋白质，这种与碳水化合物键合的蛋白质，其由 1 ～ 60 个官 能基以线性或分支结构排布，它不会在免疫系统中产生，并 缺少酶活性，常用的凝集素有伴刀豆凝集素 A（ ConA） 、麦胚 凝集素（ WGA） 、榴莲凝素等［6］。近几年来，凝集素亲和色谱 发展很快，在生物化学和制药领域都表现出它特有的优势， 在天然药物活性成分研究方面的应用也逐渐引起科研工作 者们的重视。 1. 3 细 胞 膜 色 谱 法 细 胞 膜 色 谱 法 （ cell membrane chromatography，CMC） 是由贺浪冲教授在 1996 年创建的一种 新型的具有生物活性的亲和色谱系统。生物膜上存在多种 活性蛋白，化合物能与多种受体或通道蛋白结合［7］。细胞通 过膜上的受体、离子通道等信息靶点与其他细胞、组织进行 信息传递、交流、分析、综合，维持机体内外环境的平衡，实现 生命活动。现代 药 理 学 研 究 表 明，细 胞 膜 上 的 受 体、通 道 能 选择性地识别药物中的化学成分并与之特异性结合，通过影 响细胞内第二或第三信使分子导致一定的生物效应，最终产 生药理作用。一种化合物的细胞膜通透性对于其活性起关 键作用，因为绝大多数药物必须进入细胞才能表现它的活性 而且还必须能透过目标细胞的细胞膜才能起作用。
生创新基金项 目 （ YC2013-S234 ） ； 学 校 研 究 生 创 新基金项目（ JZYC12B09） ［第一作者］ 陈芳有，硕 士，从 事 天 然 药 物 活 性 成 分 研 究，Email： tedchenfy@ 163. com ［通讯作者］ * 罗永明，博士，教授，博士生导师，从事中药药效 物 质 基 础 的 研 究，Tel： 0791-87118850，E-mail： loym999@ 163. com
第 20 卷第 11 期 2014 年 6 月
中国实验方剂学杂志 Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 20，No． 11 Jun． ，2014
亲和色谱技术在天然药物研究中的应用
陈芳有，罗永明* ，吴样明，蒋晨星，张雪莲
［Key words］ affinity chromatography； natural medicine research； biomolecules
从天然药物中寻找活性成分是天然药ຫໍສະໝຸດ Baidu研究的一项重
［收稿日期］ 20131209（ 015） ［基金项目］ 国家自然科学基金项目（ 21262019） ； 江西省研究
( 江西中医药大学药学院，南昌 330004)
［摘要］ 亲和色谱是利用生物分子与亲和色谱固定相表面配位体之间特效性亲和吸附作用来进行选择性分离生物分子 的分离方法，具有高选择性、高活性回收率和高纯度等特点，广泛的用于分离、检测或研究复杂样品中的目标分子，已逐渐成 为天然药物研究中的重要手段。本文概述了免疫亲和色谱、凝集素亲和色谱、细胞膜色谱法、固定化金属亲和色谱、分子烙印 色谱、染料配基亲和色谱、核酸适配体亲和色谱、亲和膜色谱、前沿亲和色谱等几种常用亲和色谱技术的配基的种类和选择方 法，重点介绍了它们在天然药物研究中的应用进展，并对其应用前景进行了展望。
有效部位或单体，再研究其药效，从而使成分分离与效应脱 节的弊端，因此特别适合于中药及天然药物物质基础研究。 1. 4 固 定 化 金 属 亲 和 色 谱 固 定 化 金 属 亲 和 色 谱 （ immobilized metal affinity chromatography，IMAC） 是一种具有 高度通用性的分离方法，特别是磷蛋白和键合钙蛋白的分离 和纯化。IMAC 将具有螯合作用的有机官能团或有机螯合 剂，键合在已偶联间隔臂的不同类型的亲和色谱载体上，再 与 Cu2 + ，Ni2 + ，Zn2 + ，Fe2 + ，Fe3 + ，Co2 + 等金属离子结合，生成 稳定的螯合物，利用螯合物中固定化的金属离子（ 如 Cu2 + ） 与溶液中生物分子（ 如肽、蛋白质等） 的界面相互作用，即特 效性亲和作用来实现生物分子的分离和纯化［1］。常用的具 有螯合作用的有机官能团（ 如二羰基甲胺、氨基丁二酸、羰基 甲基化天冬氨酸（ CM-ASP） 等） 和有机螯合剂（ 如亚氨基二 乙酸（ IDA 或 IDAA） 、氨三乙酸（ NTA） 、8-羟基喹啉等） ，都可 以键合到不同类型的亲和色谱载体（ 如多聚糖、苯乙烯-二乙 烯基共聚物、硅胶等） 上，生成螯合固定相。IMAC 的选择性 会随着螯合配位体的种类、固定化的金属离子的不同及亲和 解析洗脱模式的差异而改变［8-9］。 1. 5 分子烙印色谱（ MIC） 分子烙印（ molecular imprinting） 是一种可以制备出对所选目标分子（ 一般为模板分子） 具有 高度亲和性及选择性聚合物材料的技术。分子烙印聚合物 （ MIP） 材料内含有与模板分子空间结构互补官能团相互作 用（ 氢键、离子作用或范德华力等） 的孔穴，除了能高度特异 亲和模板分子以 外，对 能 与 分 子 烙 印 聚 合 物 孔 穴 形 成 匹 配 作用的模板分子结构类似物也具有很强的亲和性，但对结构 上与模板分子不相关的其他化合物只是产生较弱的表面吸 附。有机溶剂体系中分子烙印聚合物对目标化合物的良好 识别能力，使其有可能成为一种新的亲和材料，快速有效地 分离富集中草药中活性成分［10］。目前，分子烙印聚合物作 为亲和色谱固定相，即分子烙印色谱（ MIC） 主要被用在手 性化合物分离和药物筛选与分离上。 1. 6 染料配基亲和色谱 染料配基亲和色谱 （ dye ligands affinity chromatography，DLAC） 的发展始于 20 世纪 70 年代初 期。人们偶然发现很多蛋白质在蓝色葡聚糖色谱柱上的性 能有明显的差异，推测这是因为染料与蛋白质发生了相互作 用，这种相互作用类似生物大分予与其相应的生物配基之间 的亲和作用。以后的工作表明，某些活性染料能与琼脂糖等 载体共价结合，到的载体一染料联体能够分离纯化许多蛋白 质。染料配位体易与多糖基体（ 如琼脂糖、葡聚糖） 或硅胶基 体构成亲和色谱固定相，对生物分子呈现高的键合容量，并 可在中等洗脱条件下，使生物分子顺序解吸，从而获得较高 的回收率［1，11］。三嗪活性染料（ triazine reactive dye） 为主要 使用的染料配位体，此类染料分子的结构与生物酶的天然底 物相似，故可以与酶或蛋白质的活性作用点结合而用于亲和 色谱。染料配基亲和色谱就是在此基础上发展起来的。 1. 7 核酸适配体亲和色谱 核酸适配体亲和色谱（ aptamer affinity chromatography，AAC） 是将核酸适配体作为色谱固定 相上的亲和配体的一种新型色谱技术。核酸适配体是一种
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要任务 ，应用 分 析 化 学 技 术 对 天 然 药 物 成 分 进 行 分 离 和 分 析，结合药理学的药效试验，构成了天然药物研究的重要方 法。亲和色谱（ affinity chromatography，AC） 是利用生物分子 与亲和色谱固定相表面配位体之间存在的生物学和生物化 学过程的特效性亲和吸附作用来进行选择性分离生物分子 的分离方法［1］。亲和色谱技术已在新型高效药物研究、分子 生物学、蛋白质组学、临床医学等领域成为常规的分离、分析 和制备的有效 工 具［2-3］ 。 在 亲 和 色 谱 分 析 中，用 化 学 键 合 方 法可以制备多种依据不同作用机制的亲和固定相，通过产生 多种模式和多点相互作用的分离机制，可提供充分利用亲和 配位体对目 标 分 子 独 特 分 子 识 别 特 性 的、种 类 繁 多 的 色 谱