纤维素酶基因工程学及其功能性氨基酸研究进展

纤维素酶基因工程学及其功能性氨基酸研究进展
摘要：主要对纤维素酶进行概述，同时探讨了纤维素高效分解菌的选育及纤维素酶基因克隆的研究进展。

纤维素酶基因克隆及其功能性氨基酸的研究有助于深入探索纤维素酶生物合成和作用机制以及构建高效分解纤维素基因工程菌。

迄今,多种来源的纤维素酶基因已经在不同的原核或真核表达系统中获得成功。

对氨基酸序列及三维结构的研究,同时结合定点诱变技术,目前对第5、9、45糖基水解酶族中纤维素酶催化机制和功能氨基酸有了更多的认识,这有助于新纤维素酶分子的构建。

关键字：纤维素酶；纤维素分解菌；基因工程学；功能性氨基酸;催化机制;定点诱变纤维素是公认的地球上分布最广、含量最丰富、最廉价的可再生自然资源。

据估计，每年仅通过光合作用产生的纤维素就高达1 700亿吨。

我国每年的农作物秸秆总产量为7亿吨左右，但只有部分被利用，大多采用焚烧的方法进行处理。

这不但造成了资源浪费，而且造成了污染环境，因此如何充分利用纤维素对解决当前能源危机、粮食短缺以及环境污染等问题具有重要意义。

酶解法是目前降解纤维素最有效的方法。

自seil(1906)首次从蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究逐渐引起人们的重视。

自然界中存在着多种产纤维素酶的生物，利用基因工程技术筛选出高效的产纤维素酶菌株，可为纤维素酶的工业化生产及深入研究提供有力的依据。

1、纤维素酶
1．1：纤维素酶系组成与降解机制纤维素酶(Cellulase)是指能够水解纤维素β－1，4葡萄糖苷键，把纤维素降解成纤维二糖和葡萄糖的一类酶的总称。

它是由多种具有协同作用的水解酶组成的复合酶系。

根据其催化功能的不同，主要将其分为3类：①内切葡萄糖苷酶，又称葡聚糖内切酶，Ax酶(eddo-1，4-β-D-Canaseraga，EC3．2．1．4，来自真菌的简称EG，来自细菌的简称Cen)，分子质量为23～146 D；②外切葡萄糖苷酶，又称葡聚糖外切酶，C1酶，纤维二糖水解酶(ego-1，4-β-D-Canaseraga，EC3．2．1．91，来自真菌的简称CBH，来自细菌的简称Ce)，分子质量为38～118 D；③β-葡萄糖苷酶，又称纤维二糖酶(β-1．4-glucosidase，EC3．2．1．21，简称BG)，相对分子质量为76 D。

纤维素酶降解纤维素主要是3种酶协同作用的结果。

纤维素酶协同降解纤维素的作用较为复杂，而且其作用机制尚不清楚，但协同效应大大提高了个单组分的降解效率。

1．2：纤维素酶的结构和功能1986年，Tilbury等用木瓜蛋白酶限制性酶切里氏木霉(Trichomonacide Freesoil)的CBHI分子得到具有独立活性的2个结构域：①具有催化功能的催化域(Catalytic domain，CD)；②具有结合纤维素功能的纤维素结合(吸附)域(Cellulose binding domain，CBD)。

随后用类似的方法在多种细菌和真菌的纤维素酶中发现类似的结构，即由一段连接桥连接着一个催化活性的头部(CD)和楔形的尾部(CBD)结构。

不同来源的纤维素酶分子的结构和大小均有很大差别，但是其催化域CD的大小却基本一致。

纤维素酶的结合结构域CBD主要维持酶分子的构象稳定性，将酶分子连接到纤维素上。

它对酶的催化活力是非必需的，但具有调节酶对可溶性、非可溶性底物专一性活力的作用。

连接桥Linker 可保持CD和CBD之间的距离，有助于不同酶分子间形成较为稳定的聚集体。

1．3：纤维素酶的来源纤维素酶分布广泛，植物、微生物(细菌、真菌、放线菌等)、软体动物、原生动物、昆虫等都能产生纤维素酶。

但是，在植物中提取纤维素酶比较困难，且含量不高，因此目前研究的纤维素酶主要是从微生物和动物中获得。

1．3．1：微生物来源的纤维素酶。

迄今为止，已分离到的产纤维素酶的细菌有纤维单胞菌属、溶纤维丁酸弧菌属、克雷伯氏菌、假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌、热纤梭菌、芽胞杆菌等。

真菌有康氏木霉、黄绿木霉、里氏木霉、交链孢属、无孢菌群、硬内囊霉属、曲霉属、黑曲霉、拟茎点霉属、斜卧青霉等。

其中木霉属是研究最广泛的纤维素酶产生菌。

据统
计，世界纤维素酶市场中有20%的纤维素酶来自木霉属和曲霉属。

由于放线菌的纤维素酶产量极低，对其报导研究很少。

1．3．2：动物内源性纤维素酶。

最初人们认为动物自身不产生纤维素酶，而是通过体内共生生物来利用纤维素的。

据报导，昆虫中能降解纤维素的一般是肠道微生物，且多存在于后肠。

但随着研究的深入，也有试验表明大量纤维素酶是由动物自身产生的。

Scrivener 在研究食木蟑螂时发现，纤维素酶活性只在其前肠和中肠中存在，而在有大量原生生物存在的后肠中却未检测到纤维素酶，首次证明了动物体内确实存在内源性的纤维素酶。

随后，对线虫、甲虫、白蚁、福寿螺等体内纤维素酶基因的克隆进一步证明了动物内源性纤维素酶的存在。

2、纤维素高效分解菌的选育
目前，纤维素酶的生产存在着酶活力低、生产周期长等问题，还不能真正应用于大规模工业生产。

因此，选育具有纤维素酶高产能力的菌种，从根本上提高酶的产量和质量已成为国内外学者研究的重点。

2．1：自然界中菌株的筛选直接从具有纤维素分解能力的菌源中筛选，从而找出比现有菌株产酶活力高的菌株是构建纤维素高效分解菌的基础。

2009年刘占英等从蒙古绵羊瘤胃内容物中分离到1株具有较高纤维素降解率的细菌WH－1，经鉴定为溶纤维丁酸弧菌属(Distributivity fibrinogens)的溶纤维丁酸弧菌(Distributivity fibrinogens)。

目前，纤维素酶产生菌的筛选除了寻找高活力的产酶菌外，同时寻找具有特殊活性的产酶菌株，如中性、碱性纤维素酶，低温、高温纤维素酶等。

2006年Baur J等筛选到1株嗜热菌(Melano-carpus sp．)可产生较高活力的耐热、中性纤维素酶，有可能成为一个产纤维素酶的优良菌株。

2008年李忠玲等从造纸厂的土壤中筛选出产碱性纤维素酶的兼性厌氧菌株LZ－5，经鉴定为弧菌属(Vibrio sp．)中的一个种。

2．2：诱变选育由于直接从自然界中筛选出的野生型菌株产酶能力较低，所以人们通过诱变选育的方法对所筛选的菌株进行改造以获得具有高产酶活力的突变菌株。

诱变主要包括物理诱变和化学诱变。

物理诱变主要是利用紫外线照射来改变菌体本身的遗传物质，使其产生新的性状。

化学诱变则是采用一些化学诱变剂，如甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝基胍(NTG)、亚硝酸、硫酸二乙酯(DES)、氯化锂等。

目前，多种诱变技术相结合的复合诱变已广泛用于纤维素酶菌种诱变选育。

2004年C hand等用溴乙锭和亚硝基胍复合诱变，在含有两性霉素B浓度为2μg/ml的平板上选育出木霉属抗性突变株CMV5－A10，其FPA酶活、CMC酶活分别是野生菌的2．2倍和2．1倍。

Adsum等研究表明Penicillium anthelminthic NCIM1171经过硫酸二乙酯处理24 h，然后紫外线处理3 min能得到产酶提高和透明圈明显的菌株，可在含0．2%2－脱氧-D-葡萄糖的培养基上迅速生长。

然后转到含1．5%的2-脱氧-D-葡萄糖的培养基有5个突变体。

林建国等利用紫外、硫酸二乙酯和亚硝基胍3种诱变方法对发菌株绿色木霉进行诱变育种，得到一突变菌株，其产酶能力最高值为437U/(g·min)，是出发菌株的2．03倍。

方尚玲等对分离筛选出的1株产纤维素酶活力较高的木霉(CMC酶活609．51U/g 干曲、FPA酶活133．85 U/g干曲)进行紫外线及原生质体紫外线复合诱变，得到了产酶活力很高的菌株，其CMC酶活达到1 332．90 U/g干曲，FPA酶活达到301．61 U/g干曲，分别为原始菌株的2．19倍、2．25倍。

3、纤维素酶的基因工程学研究
随着生物技术的发展，利用基因工程手段构建纤维素高效分解基因工程菌已成为关键。

自1982年Whittle等首次报导Noncellulosic Mimi的纤维素酶基因被克隆以来，人们不断从细菌与真菌中发现并分离纤维素酶系。

目前，已测定100多个细菌和真菌的纤维素酶基因序列，并且都已在大肠杆菌、毕赤酵母等多种宿主菌中表达。

3．1：纤维素酶基因在大肠杆菌中的克隆与表达蔡勇等克隆了芽孢杆菌CY1-3株的碱
性纤维素酶基因cel并在大肠杆菌中获得表达。

尹捷等成功克隆了一段来自腾冲嗜热厌氧杆菌(Nitrobacteria congestion)编码Pb(436个氨基酸残基)的开放阅读框(ORFTTE0337)，并在大肠杆菌BL21中有活性地表达。

纯化后的重组Pb(rPbgL)经SDS-PAGE分析，为1条分子量约50kD的蛋白条带，与推测的分子量大小一致。

Ken taro Aka-molto等在日本盐水蛤(Corbicula japonica)中克隆到内源性纤维素酶基因CjCel45A和CjCel45B，经测得CjCel45A 和CjCel45B基因均属糖基水解酶家族45，其中CjCel45A在大肠杆菌中成功表达。

官兴颖等对枯草芽孢杆菌C-36内切葡聚糖酶基因在大肠杆菌中进行了克隆及表达，经测定表达蛋白酶比活力达99 102 U/ml，为出发菌C236(63 178U/ml)的1．55倍。

Bin Tang等对匍茎根霉菌(Rhizopus var．)TP-02的内切葡聚糖苷酶(EG)基因进行克隆，并在大肠杆菌BL21中表达，重组的菌体在36 h时酶活力最高，测得重组蛋白分子量为40 D。

石贤爱等克隆一株长梗木霉菌株的bgl2、cbh2和eg1基因，序列分析表明这3种纤维素酶基因与Gen Bank上其他木霉同种纤维素酶基因具有较高同源性。

C hun-Han Ko等从芽孢杆菌(Pneumobacillus Campinas)BL11中克隆到Cel-BL11基因
并在大肠杆菌中获得融合表达，测得重组蛋白的分子量为38 D。

目前，人们已克隆了里氏木霉的cbh1、cbh2、eg1、eg2、eg3、eg4、eg5、bg1、bg2等纤维素酶基因，均在大肠杆菌(E．choli)中得到了表达，并测定了这些基因的核苷酸序列。

3．2：纤维素酶基因在其他宿主菌中的克隆表达在纤维素酶基因的分子改造方面，作为原核表达系统的乳酸杆菌逐渐引起人们的注意。

近年来，已有很多学者将克隆到的纤维素酶基因成功在乳酸杆菌中表达。

Bates等将Thermoluminescence的内切葡聚糖酶基因成功克隆并在植物乳杆菌中表达。

Trees Schrecklich等研究了克隆表达到植物乳杆菌中的淀粉酶和内切葡聚糖酶的稳定性，结果表明将外源基因以同源重组的方式整合到植物乳杆菌的染色体上，能有效提高外源基因的表达稳定性。

赵莹等将纯化的CBHⅡ基因和非抗性穿梭表达载体pW425t进行连接，构建重组质粒pW425t-CBHⅡ，并将pW425t-CBHⅡ转化至thuya基因缺陷型的乳酸杆菌感受态细胞中，测得CBHⅡ的反应最适温度为50℃、最适pH为5．0。

当温度50℃、pH5．0时，重组乳酸杆菌的CBHⅡ的酶活力达到0．115 62 U/ml。

此外，纤维素酶基因在酵母中的表达也逐渐引起了人们的重视。

刘海英等将长梗木霉SSL的eg1基因表达于毕赤酵母，经甲醇诱导后，胞外重组内切葡聚糖酶I的活力达73 U/ml。

田生礼等应用PCR技术从嗜碱性芽孢杆菌A TCC21833中扩增碱性纤维素酶基因，克隆至酵母整合型表达载体PGAαA中，构建重组表达质粒PGAαA-ATCC21833，并转化至巴氏毕赤酵母GS115，成功构建了表达碱性纤维素酶的巴氏毕赤酵母工程菌。

王宝维等克隆了鹅源草酸青霉F67的CBHⅠ基因并构建真核表达载体，为将该菌株进一步在真核宿主酵母中表达从而获得高效工程菌株奠定了基础。

4功能性氨基酸残基的研究
采用蛋白质工程方法,构建具有可完全降解结晶纤维素的纤维素酶分子,是纤维素酶向工业化应用的重要途径,其中纤维素酶功能性氨基酸残基的研究是实现这一途径的基础。

随着基因测序、结构基因组学和应用物理学方法的的不断发展与应用,人们对纤维素酶氨基酸序列和三维结构的认识不断深入,从而为研究功能性氨基酸残基奠定了基础。

为了确定哪一个氨基酸残基为纤维素酶的催化作用所必需,人们运用定点诱变技术,利用合成的寡核苷酸作诱变物,按照设计的方案,在已知的核苷酸序列中准确地诱变密码子中的一个或数个碱基,改变组成蛋白质的一个或数个氨基酸残基,以确定功能性氨基酸基团,在这方面已取得了许多进展。

纤维素酶属于糖基水解酶。

根据氨基酸序列的相似性可把糖基水解酶分为82个族,纤维素酶占其中的13个族[10]。

目前对第5、6、7、9、45族的催化机制和功能氨基酸的研究成果较多。

族5的纤维素酶为内切酶,结构上具有(αΠβ)8折叠桶结构,以底物异头碳原子位的构型保留进行催化反应[10]。

对这一族Bacillussp1的纤维素酶研究开展的较早,发现这些高度同源的纤维素酶的酶反应最适pH有较大的差异,如B1subtilis为中性纤维素酶(BSC),Bacillussp1N4为碱性纤维素酶(NK1),Park等[11]运用定点诱变技术,在碱性环境下用Ain和Ser分别代替NK1’region5’中的Ser287和Ala296,结果使得NK1的酶反应pH范围与BSC的几乎一致,这表明Ser287和Ala296对碱性环境NK1的活性起着重要的作用。

但在酸性范围内,’region5’中的各种氨基酸取代都不影响其酶反应pH范围。

根据这一发现,Park 推断Ser287和Ala296为影响酶反应pH范围的功能性氨基酸残基,并且认为Ser287和Ala296的替代严重影响形成底物吸附位点或催化位点的氢键网重组。

族9纤维素酶的结构和催化机制与族8相同。

Clostridi2um1stercorariumCel属于这一族,Lieder等[17]推断其催化残基为Asp84和Glu447,位于蛋白的N-末端,取代Cel的一个或两个催化残基,结果完全消除了其对微晶纤维素的攻击能力,但在水解CMC时,却检测到了Asp84替代物的内切酶活性,Lieder推测这有可能是发生在CMC上的羧化作用而引起的“催化拯救”作用造成的,这与族6纤维素酶的研究情况非常相似。

族45纤维素酶的结构研究并不透彻,但已弄清其通过底物异头碳原子位构型的转化进行催化反应。

H1insolensCel45A是这一族的代表,具有很强的除垢功能。

Schuln[18]对其底物吸附沟的残基Tyr147进行了研究,诱变动力学分析表明,这一区域的芳香族氨基酸对吸附有很重要的作用。

而Davies[19]对其的研究发现其结构由一个带有互相连接长环的六链桶组成,而且在酶的表面有一个40!的沟,包含催化残基Asp10(可能为碱催化剂)和酸催化剂Asp121。

利用定点诱变技术对纤维素酶功能性氨基酸的研究在很大程度上验证了纤维素酶的催化机理,但是在许多纤维素酶体系里,对于其碱催化剂的鉴别以及是否存在还有很大的争论,所以还需进一步的探讨。

另外,功能性氨基酸残基的研究还涉及了热稳定性、pH稳定性、底物特异性、吸附亲和力等方面,由此可以对纤维素酶蛋白分子进行改造和设计,这对该酶在工业生产上的应用具有十分重要的意义。

4、小结
目前，国内外在纤维素菌株的选育和纤维素酶基因克隆方面已取得了重要进展，但由于选育的许多菌种产酶活性低、菌种易退化等问题致使纤维素酶的工业化生产受到局限。

因此，纤维素高效分解菌的选育仍然是纤维素酶研究的重点之一。

同时，利用基因工程技术对纤维素酶基因进行克隆和异源表达，为研究纤维素酶的生物合成和作用机制、了解纤维素酶遗传特性进而构建高效纤维素酶分解菌等方面开辟了新途径。

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