淀粉酶的固定化生产

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七、思考题
（1） 固定化细胞发酵与流离细胞发酵比较，有哪 些优点，在实际应用中存在哪些问题？
（2）试说明以海藻酸钠为载体，以CaCl2为交联剂 的凝胶机理？
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1、有时候读书是一种巧妙地避开思考 的方法 。20.1 0.620.1 0.6Tues day, October 06, 2020
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二、实验原理
细胞固定化技术： 固定化细胞就是被限制自由的细胞。即采用
物理或化学的方法将细胞固定在载体上或限度在 一定的空间界限内，但细胞仍保留催化活性并能 反复或连续使用。
游离细胞
固定化细胞
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微生物在固定化后以其生长状态可分为3类： 固定化死细胞； 固定化活细胞（休眠状态）； 固定化增殖细胞（生长状态）。
微生物发酵工程实验
环境与生物工程实验教学中心
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实验四、淀粉酶的固定化生产
一、实验目的 二、实验原理 三、实验材料 四、实验步骤 五、实验结果 六、注意事项 七、思考题
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Hale Waihona Puke Baidu
一、实验目的
学习细胞固定化的原理，通过海藻酸 钠包埋固定产淀粉酶的酵母，掌握菌体包埋 固定的基本方法，了解固定化细胞在实际中 的应用。
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四、实验步骤
（一）培养基灭菌 ➢ 取250ml三角瓶，分别放入配好的液体培养基 100ml，灭菌冷却。 （二）种子活化和接种 ➢ 酵母菌接入培养基，25℃培养活化，取活化后的 酵母菌分别接入已灭菌冷却的三角瓶培养瓶，振荡混 匀。
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四、实验步骤
（三）培养 ➢ 将已接种的三角瓶培养液置于振荡培养箱， 200r/min，25℃培养，离心收获菌体并用无菌水洗涤一 次，制备菌悬液，使其中酵母菌数为数量级107个/ml。 （四）海藻酸钠及交联剂的制备 ➢ ①海藻酸钠溶液的制备：取海藻酸钠1.5g，2.0g， 2.5g，3.0g，3.5g，分别置于250ml三角瓶中，各加入 100ml蒸馏水，放置并搅拌，灭菌。 ➢ ②交联剂的制备：配制2%浓度的CaCl2，灭菌。
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六、注意事项
1.加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及 到实验的成败，一定要按照要求进行操作。海藻酸钠的浓 度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将 很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的 酵母细胞的数目少，影响实验效果。
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六、注意事项
2.刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以 便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使 用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用 手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明 凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如 果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。
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三、实验材料
1. 酵母菌细胞：面包酵母。 2.培养基：
①发酵培养基：葡萄糖：4%；蛋白胨：1%；磷酸二氢 钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%酵母膏：0.5%，pH： 5.5-6.5。 ②固定化培养基：淀粉：2％；葡萄糖：0.5%；蛋白胨： 1%；磷酸二氢钾：0.5%；七水硫酸镁：0.2%；酵母膏： 0.5%，pH：5.5-6.5。 3. 海藻酸钠溶液及交联剂CaCl2溶液。
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四、实验步骤
（五）固定化酵母的制备 ➢ ① 将酵母湿细胞与20ml海藻酸钠溶液混合均匀； ➢ ② 用注射器（不用针头）将海藻酸钠—酵母菌混 合液点滴滴入CaCl2溶液中，形成球状颗粒； ➢ ③ 常温下静置2h，使其充分固化； ➢ ④ 滤出凝胶颗粒；用无菌水洗涤2~3遍，即得固定 化酵母细胞。
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最令人感兴趣的是固定化增殖细胞，因为 多数微生物代谢的产物与其生长相关。
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微生物细胞的固定化方法有： （1）吸附法， （2）包埋法， （3）不用载体法。
包埋法
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本实验采用凝胶包埋的固定化方法，把 酵母细胞悬浮在海藻酸钠溶液中，再滴加入 CaCl2溶液，形成海藻酸钙凝胶小球，细胞 包埋在凝胶的小孔中，制成固定化细胞。
四、实验步骤
（六）固定化酵母的增殖 ➢ 将固定化颗粒投入增殖培养基中进行增殖， 25℃、200r/min下增殖48h，观察固定化细胞的大小。
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五、实验结果
（1）海藻酸钠的浓度对固定化效果的 影响。
（2）利用DNS法检测培养液中葡萄糖浓 度，以确定是否产生了淀粉酶，经过一段时 间培养，滴入碘液，看是否有蓝色产生。