黑曲霉木聚糖酶的同源表达及其高产木聚糖酶发酵条件的优化

黑曲霉木聚糖酶的同源表达及其高产木聚糖酶发酵条件的优化倪大伟;李瑞云;白爱枝;张文涛;王军

【摘要】构建的木聚糖酶xynB表达载体pBS-XTP在黑曲霉(Aspergillus niger)表达系统中实现了高表达,并对基因工程菌A70的发酵特性及产木聚糖酶的条件进行了优化.采用单因素实验法和L9(34)的正交实验优化菌种产酶条件,优化得到摇瓶产酶条件为:玉米芯质量浓度80 g/L,麸皮质量浓度18 g/L,糖蜜质量浓度14

g/L,NaNO3 g/L,用30 mL无氮Mandels营养液配制发酵液.在发酵温度为28 ～30℃,接种量为0.5％,装液量30mL/瓶,摇床转速为220 r/min,发酵时间96 h,菌株A.niger A70产酶水平达12 664 U/mL,是优化前的3.5倍,较出发菌株A.niger

A327产酶水平提高约60倍.

【期刊名称】《食品与发酵工业》

【年(卷),期】2015(041)004

【总页数】6页(P48-53)

【关键词】基因工程菌;木聚糖酶;表达;发酵;活力

【作者】倪大伟;李瑞云;白爱枝;张文涛;王军

【作者单位】内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古大学生命科学学院,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古自治区离子

束生物工程重点实验室,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特,010021;内蒙古大学物理科学与技术学院,内蒙古呼和浩特,010021【正文语种】中文

黑曲霉(Aspergillus niger)具有多种活性较强的酶系，是重要的酶制剂生产菌种，也是木聚糖酶的生产菌种之一。随着真菌基因组学和基因微阵列及蛋白质组学等实验技术的发展，利用丝状真菌作为宿主表达同源和异源蛋白也得到快速发展和应用［1］，黑曲霉作为丝状真菌的代表性菌种之一，其表达系统也越来越受到科技工作者的关注［2-3］。黑曲霉是国际公认的安全生产菌株［4］，并且其本身具有强大的蛋白质胞外分泌能力，有完善的翻译后加工功能及成熟的发酵工艺等优点，是外源和内源蛋白表达的优良宿主。

木聚糖酶是一种重要的工业酶制剂，在食品、饮料、造纸和饲料等方面有广泛的应用。目前市场上大部分高效木聚糖酶产品的技术核心都属于国外公司，因此通过基因工程技术，构建高表达的木聚糖酶工程菌，对于降低木聚糖酶的价格促进其应用水平，是国内木聚糖酶工业所面临的最紧迫的问题。黑曲霉产木聚糖酶基因xynB 的同源表达研究的甚少，2005年Anthony等［5］利用 RT-PCR 从 A.niger BRFM281 mRNA扩增的带有6个his标签的xynB基因克隆到有gpd强启动子的表达盒，将该表达盒在蛋白酶阴性突变株Aspergillus niger D15#26中进行表达，获得的1株基因工程菌的木聚糖酶产量达到900 mg/L，酶活力为625 U/mL;国内的郑瑞娟［6］从A.niger TS1中利用同样方法克隆得到xynB基因，通过构建与葡萄糖淀粉酶的融合表达质粒，在尿嘧啶缺陷型A.niger M54中表达，获得的重组菌的酶活力最高达507 IU/mL，分别是原出发菌和宿主菌的6.7倍和3.89倍。Record等［7］利用 Aspergillus nidulans gpd基因的启动子、5’非编码

区和终止子将A.niger来源的阿魏酸脂酶faeA基因进行同源表达，表达量较原始菌株提高24.5 倍，达 1 g/L;Anthony Levasseur［8］采用同样的策略表达

A.niger BRFM131的阿魏酸脂酶faeB基因，产量较原菌株提高了16倍;同源表

达较之异源表达，可有效避免异源表达中难以解决的问题，如分泌过程中蛋白的错误折叠和被内源蛋白酶降解的可能以及物种密码子的偏好性、基因结构的复杂性等，多种蛋白酶同源表达的成功，表明该策略具有广泛的应用价值。本实验室从

A.niger A327中克隆了木聚糖酶基因xynB［9］，采用同源表达策略将其表达在黑曲霉菌株A.niger A327中，本文对木聚糖酶活力最高的转化子A.niger A70菌株的摇瓶发酵条件进行了优化。

1 材料与方法

1.1 菌株与载体

出发菌株黑曲霉A.niger A327，由内蒙古自治区离子束生物工程重点实验室保藏;质粒 VHb和p3SR2由中国科学院微生物所唐国敏教授惠赠。

1.2 主要仪器与试剂

TU-1800PC紫外-可见分光光度计，北京谱析通用仪器设备有限责任公司;DYY-12型电泳仪，北京六一;ZHWY-1102/1121型普通摇床，上海智诚，主要试剂:木聚

糖(birchwood xylan)，美国sigma公司;玉米芯麸皮购于呼和浩特市郊，玉米芯

经粉碎机粉碎后备用;其他化学试剂均为国产分析纯。

1.3 表达载体的构建及其表达

从A.niger A327中克隆编码xynB结构基因及其5’调控区序列片段，总长

1611bp，将其与目的载体pBS-T 连接［5］，并转化E.coli DH5α，挑取单克隆，鉴定阳性克隆子，分别将从质粒VHb和质粒p3SR2酶切得到的来源于

A.nidulans的终止子TtrpC和选择标记基因amdS连接到已连入xynB基因的T

载体中，得到表达载体pBS-XTP(图12，并利用原生质体转化技术将表达载体转

入菌株A327中，通过摇瓶发酵筛选产木聚糖酶活力最高的转化子。

图1Fig.1

1.4 木聚糖酶活力的测定方法［10］

取适当稀释的粗酶液0.1 mL，加到1 mL、1%的桦木木聚糖悬浮液中(pH5.0，

0.2 mol/L醋酸缓冲液配制)于50℃水浴反应10 min，用 DNS(3，5-二硝基水杨酸)法，测定产生的还原糖。以木糖为标准，在本实验条件下，每分钟产生1 μmol 还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位U/mL。

1.5 培养基和培养方法

分离培养基(g/L):麸皮5，蛋白胨1，琼脂20，Manders营养盐液［11］定容 1 000 mL，pH 自然。PDA培养基(g/L):马铃薯200(去皮、切块煮30 min，纱布过滤)，葡萄糖20，琼脂15，蒸馏水定容至1 000 mL，pH自然。基础产酶培养基(g/L):玉米芯75，麸皮24，Manders营养盐液 1 000 mL，pH5.5 ～6.0。以上

培养基在没有添加糖蜜的情况下均在121℃灭菌30 min，添加糖蜜的培养基在115℃灭菌30 min;固体培养，置于30℃下培养4～5 d;液体培养，30℃下，摇瓶培养发酵4 d，摇床转速为200 r/min。

1.6 基因工程菌产木聚糖酶条件优化

1.6.1 培养基的单因素优化

在初始发酵培养基的基础上，保持其他条件不变，分别添加不同浓度的玉米芯(40，50，60，70，80，90 g/L)，不同浓度的麸皮(15，20，25，30 g/L)，不同浓度

的糖蜜(0，2，4，6，8，10 g/L)以及浓度均为 6 g/L的不同氮源((NH4)2SO4、NaNO3、NH4NO3、蛋白胨、尿素)，进行摇瓶发酵，研究各因子对木聚糖酶酶

活的影响。

1.6.2 发酵条件优化

在基础产酶培养基的条件下，分别设置不同温度(25℃(室温)、28℃(黑曲霉A327