第一节生物变异的来源
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6、1970年，阿尔伯、内森斯、史密斯在细菌中发现了第一个分离出限制 酶
7、1971年，创立第一家生物工程公司 8、1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
9、1973年， （科恩）Cohen和Herbert Boyer（博耶），研发了DNA克隆技 术和重组DNA技术。
今天，我们就沿着这两位科学家的研究历程，重新回顾科学奇迹。
含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101
具体背景：博耶和科恩选用仅单一EcoR I 酶切位点的质粒pSC101，使非
洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一
EcoR I 酶切位点
3、宿主：
没有四环素抗性的大肠杆菌
基因工程的原理和技术二轮复习
张碧滢
基因工程考试要求
1.工具酶的发现和基因工程的诞生[加试(a)]。 2.基因工程的原理和技术[加试(b)]。 3.基因工程的应用[加试(a)]。
Байду номын сангаас
基因工程思维导图构建 操作工具
操作程序 基因工程
限制性核酸内切酶 功能和作用
DNA连接酶
识别特异性的DNA序列并切割
载体 获取目的基因
连接的对象是？ 有互补的粘性末端或者平末端的DNA片 段
形成重组DNA分子
将目的基因导入受体细胞
筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因的表达
应用
转基因植物 转基因动物 基因工程药物（转基因微生物） 基因治疗
在基因工程发展前的生物重大事件 1、1944年，艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎双球菌转化实验，证明了 DNA是遗传物质
要求： 1、请根据基因工程的步骤，模拟出：形成重组DNA分子，质粒上 的虚线表示酶切位点， 2、展示酶切后的质粒和目的基因混合后的产物的不同形式，目的 基因可以直接覆盖在载体上。 3、请选择处于感受态的大肠杆菌，展示出重组DNA成功进入细胞 的细菌状态。
将酶切后的质粒和目的 基因混合，放入试管中
思考：
2、1953年：沃森(J. D. Watson)，克里克提出的DNA结构 3、1960年，斯坦福大学的阿瑟·科恩伯格体外合成DNA
4、1958年，梅赛而松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
在基因工程发展前的生物重大事件
5、1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒可以作为基因 转移的运载工具。
1、用CaCl2处理后的大肠杆菌的细胞壁通透性变大，对细胞有一定的损害 作用，在转化后，如何让细胞壁的通透性恢复正常？
浙江卷2018-4月真题
已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCI2处理过的农 杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆 菌，完成_______实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速 培养一段时间，其目的是_______，从而表达卡那霉素抗性基因，并 大量增殖。 使CaCI2处理过的农杆菌恢复细胞的 四环素
EcoR I 酶切位点
判一判 5、表达成功的标志：
在大肠杆菌中检测到了核糖体相关的蛋白质
对阳性菌落如何扩大培养？
挑取单菌落接种到液体培养基中，置于摇床上进行培养。
动一动 把全班学生分为6组，每组6-7人左右，每组设一组长，负责指导和作品展示
每组材料：爪蟾的基因（含目的基因），若干个完整的质粒pSC101 ，阴影 部分代表四环素抗性基因，两种大肠杆菌，剪刀，透明胶
4、构建所用的酶
酶切一个酶切位点需要断几个磷酸二酯键？
整理后的实验内容
质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一EcoR
I 酶切位点 判一判
6、转化方式： CaCl2转化法
7、筛选的培养基种类： 固体，含有四环素抗性
8、筛选对象：能在培养基中长出菌落的
9、培养基中长出的菌落一定含有目的基因么？
科学史介绍
人物：Cohen 科恩
Cohen是斯坦福大学的医学教授，他 和他的学生在实验室实现了质粒DNA 转入到了大肠杆菌中，同时该质粒可 以在大肠杆菌中稳定保存， Cohen看 到了里面的前景，猜测如果DNA可以 在大肠杆菌中稳定遗传，那么就可以 在大肠杆菌中大量扩增。
Cohen
基因工程的诞生是在一家熟食店
洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一
EcoR I 酶切位点
判一判
1、目的基因及获得方式： 来自非洲爪蟾核糖体某基因片段， 已知片段，化学合成法或者PCR技术，当时怎么合成不知
2、载体：
作为运载体的必备条件？
1973年，Boyer与Cohen的合作开花结果，利用Boyer发现的限制
性核酸内切酶EcoR I ，成功在Cohen分离的质粒pSC101上实现基因
重组，并且表达出相应的生物学功能，这篇论文宣告基因工程的诞 生，创建了划时代意义的分子生物学方法，为基因工程研究奠定基 础。
整理后的实验内容
具体背景：博耶和科恩选用仅单一EcoR I 酶切位点的质粒pSC101，使非
不能，该菌落中的大肠杆菌里面有可能只含有一个自我环化的质 粒（由于当时只用了一种酶进行酶切，形成的粘性末端相同，质 粒容易自我环化）
具体背景：博耶和科恩选用仅单一EcoR I 酶切位点的质粒pSC101，使非
洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一
两人本来没有交集，在1972年的一次学术交流会上，Boyer认识了 比他大一岁的Stanley Norman Cohen，Cohen当时正在研究细菌质粒， 研究将质粒引入大肠杆菌研究。 Herbert Boyer（博耶）正在会议上展
示了对EcoR I 酶的研究成果。一次在夏威夷海滩附近的一家熟食店吃 夜宵时，讨论了想将EcoR I 酶酶切质粒，然后引入大肠杆菌的设想。
科学史介绍
人物：Herbert Boyer，博耶
基因工程之父,是加州大学旧金山分校的 生物化学家。读书期间，Boyer主要研究 细菌质粒和限制酶，他认为限制酶可能 成为非常有用的基因工程工具，1972年， Boyer在大肠杆菌中发现了一种限制酶， 也就是后来著名的限制性核酸内切酶 EcoR I。EcoR I能专一识别GAATTC序 列，并在G和A之间切开产生黏性末端。
7、1971年，创立第一家生物工程公司 8、1972年，伯格成功构建了第一个体外重组DNA分子。
9、1973年， （科恩）Cohen和Herbert Boyer（博耶），研发了DNA克隆技 术和重组DNA技术。
今天，我们就沿着这两位科学家的研究历程，重新回顾科学奇迹。
含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101
具体背景：博耶和科恩选用仅单一EcoR I 酶切位点的质粒pSC101，使非
洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一
EcoR I 酶切位点
3、宿主：
没有四环素抗性的大肠杆菌
基因工程的原理和技术二轮复习
张碧滢
基因工程考试要求
1.工具酶的发现和基因工程的诞生[加试(a)]。 2.基因工程的原理和技术[加试(b)]。 3.基因工程的应用[加试(a)]。
Байду номын сангаас
基因工程思维导图构建 操作工具
操作程序 基因工程
限制性核酸内切酶 功能和作用
DNA连接酶
识别特异性的DNA序列并切割
载体 获取目的基因
连接的对象是？ 有互补的粘性末端或者平末端的DNA片 段
形成重组DNA分子
将目的基因导入受体细胞
筛选含有目的基因的受体细胞 目的基因的表达
应用
转基因植物 转基因动物 基因工程药物（转基因微生物） 基因治疗
在基因工程发展前的生物重大事件 1、1944年，艾弗里（O.Avery）等人通过肺炎双球菌转化实验，证明了 DNA是遗传物质
要求： 1、请根据基因工程的步骤，模拟出：形成重组DNA分子，质粒上 的虚线表示酶切位点， 2、展示酶切后的质粒和目的基因混合后的产物的不同形式，目的 基因可以直接覆盖在载体上。 3、请选择处于感受态的大肠杆菌，展示出重组DNA成功进入细胞 的细菌状态。
将酶切后的质粒和目的 基因混合，放入试管中
思考：
2、1953年：沃森(J. D. Watson)，克里克提出的DNA结构 3、1960年，斯坦福大学的阿瑟·科恩伯格体外合成DNA
4、1958年，梅赛而松和斯塔尔用实验证明了DNA的半保留复制。
在基因工程发展前的生物重大事件
5、1967年，罗思和赫林斯基发现细菌拟核DNA之外的质粒可以作为基因 转移的运载工具。
1、用CaCl2处理后的大肠杆菌的细胞壁通透性变大，对细胞有一定的损害 作用，在转化后，如何让细胞壁的通透性恢复正常？
浙江卷2018-4月真题
已知用CaCl2处理细菌，会改变其某些生理状态。取CaCI2处理过的农 杆菌与重组质粒在离心管内进行混合等操作，使重组质粒进入农杆 菌，完成_______实验。在离心管中加入液体培养基，置于摇床慢速 培养一段时间，其目的是_______，从而表达卡那霉素抗性基因，并 大量增殖。 使CaCI2处理过的农杆菌恢复细胞的 四环素
EcoR I 酶切位点
判一判 5、表达成功的标志：
在大肠杆菌中检测到了核糖体相关的蛋白质
对阳性菌落如何扩大培养？
挑取单菌落接种到液体培养基中，置于摇床上进行培养。
动一动 把全班学生分为6组，每组6-7人左右，每组设一组长，负责指导和作品展示
每组材料：爪蟾的基因（含目的基因），若干个完整的质粒pSC101 ，阴影 部分代表四环素抗性基因，两种大肠杆菌，剪刀，透明胶
4、构建所用的酶
酶切一个酶切位点需要断几个磷酸二酯键？
整理后的实验内容
质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一EcoR
I 酶切位点 判一判
6、转化方式： CaCl2转化法
7、筛选的培养基种类： 固体，含有四环素抗性
8、筛选对象：能在培养基中长出菌落的
9、培养基中长出的菌落一定含有目的基因么？
科学史介绍
人物：Cohen 科恩
Cohen是斯坦福大学的医学教授，他 和他的学生在实验室实现了质粒DNA 转入到了大肠杆菌中，同时该质粒可 以在大肠杆菌中稳定保存， Cohen看 到了里面的前景，猜测如果DNA可以 在大肠杆菌中稳定遗传，那么就可以 在大肠杆菌中大量扩增。
Cohen
基因工程的诞生是在一家熟食店
洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一
EcoR I 酶切位点
判一判
1、目的基因及获得方式： 来自非洲爪蟾核糖体某基因片段， 已知片段，化学合成法或者PCR技术，当时怎么合成不知
2、载体：
作为运载体的必备条件？
1973年，Boyer与Cohen的合作开花结果，利用Boyer发现的限制
性核酸内切酶EcoR I ，成功在Cohen分离的质粒pSC101上实现基因
重组，并且表达出相应的生物学功能，这篇论文宣告基因工程的诞 生，创建了划时代意义的分子生物学方法，为基因工程研究奠定基 础。
整理后的实验内容
具体背景：博耶和科恩选用仅单一EcoR I 酶切位点的质粒pSC101，使非
不能，该菌落中的大肠杆菌里面有可能只含有一个自我环化的质 粒（由于当时只用了一种酶进行酶切，形成的粘性末端相同，质 粒容易自我环化）
具体背景：博耶和科恩选用仅单一EcoR I 酶切位点的质粒pSC101，使非
洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达。 质粒介绍：含有四环素（tet）抗性基因的大肠杆菌质粒pSC101，单一
两人本来没有交集，在1972年的一次学术交流会上，Boyer认识了 比他大一岁的Stanley Norman Cohen，Cohen当时正在研究细菌质粒， 研究将质粒引入大肠杆菌研究。 Herbert Boyer（博耶）正在会议上展
示了对EcoR I 酶的研究成果。一次在夏威夷海滩附近的一家熟食店吃 夜宵时，讨论了想将EcoR I 酶酶切质粒，然后引入大肠杆菌的设想。
科学史介绍
人物：Herbert Boyer，博耶
基因工程之父,是加州大学旧金山分校的 生物化学家。读书期间，Boyer主要研究 细菌质粒和限制酶，他认为限制酶可能 成为非常有用的基因工程工具，1972年， Boyer在大肠杆菌中发现了一种限制酶， 也就是后来著名的限制性核酸内切酶 EcoR I。EcoR I能专一识别GAATTC序 列，并在G和A之间切开产生黏性末端。