第六章固相萃取技术

5、SPE –vacrc 这种小柱是为手工或使用自动样品处理器 而设计，柱体为20ml― 漏斗 ”型，用于填料有 100mg 或 500mg,可允许较大的样品量或溶剂 量。
表1 spe-pak小柱的类型及吸附剂的重量
§6—3 固相萃取小柱的使用方 法
一、正相色谱机理在小柱硅胶、氧化铝、硅酸镁、 醇基、氨基上的应用
3、SPE -light小柱 这种小柱是为有 限的样品量而设计的， 内部体积只有plus小 柱的三分之一，可在 较小的体积下洗脱镏 分，可改善回收率及 减少溶剂的消耗
4、SPE -vac小柱 这种小柱柱体是 一个注射管，可允许 较大体积的样品的注 入 ， 体 积 从 1 ml 到 3 5 ml， 填 料 量 从 50mg到10g

此外，固相萃取法还有许多优点：如选择 性强、分离时间短、使用有机溶剂少等等。 目前在国际上SPE技术已在许多领域里逐 渐取代LLE 。 SPE的最突出优点之一是便于自动化，而 SPE的自动化使繁琐、复杂、费时的样品前处理 发 生了一个飞跃性的变化 。
固相微萃取技术 (solid phase microextraction,SPME)是在常规基础上发展 起来的，由Pawlizyn等首创，并很快实现了商 品化。 常规SPE需用少量溶剂作 冲洗剂，SPME 则可不用萃取溶剂，是真正意义上的固相萃取。 常规SPE主要用于HPLC和IC。SPME除可用于 GC 还可用于 UV吸收光谱AAS、I CP-AES、 CE或MS等，并可于电分析化学，应用前景十 分广阔。
2、 加样 3、 用 水洗去不感兴趣的组分 4、 组分1 5 、 组分2 6、 弃去用过的小柱
离子交换机理应用示意图
§6—4 固相萃取小柱的应用范围
SPE小柱应用范围 填料 硅胶 应用范围 非极性样品—天然产品、杀虫剂、油脂 人造有机化合物 极性样品—水溶性环境与生化样品， 在血清、尿中的药物及其新陈代谢 脂溶性样品—变压油中的，食品、 饲料中的杀虫、杀草剂 酸性样品 阴离子交换—饲料中的维他命 食品、抗生素、添加剂
二、有机磷杀虫剂的SPE固相萃取
含200mgC18和C8反相硅胶柱 1、柱活化 用两倍体积量甲醇过柱 2、加入含混和有机磷杀虫剂10ppm样品水溶液 70ml通过柱，流速为3~5ml/min 3、用去离子水淋洗柱一次 4、洗脱： 用1ml＊2的甲基丁基醚 (MTBE,Methltortbutul ether)将有机磷洗脱，洗脱液继而通过第二根 含有无水硫酸钠的柱，收集洗脱液于10 ＊75mm的 试管内。本法应用GC/FPD检测21种有机磷杀虫剂 的回收率为77 ~ 92%. 柱
增加溶剂的极性、洗脱不感兴趣的组份
1、用非极性溶剂活化平衡小柱 2、加样 3、洗脱不感兴趣组份 4、组份1 5、组份2 6、弃去用过的小柱
正相色谱机理应用示意图
活化的目的： 1） 净化柱子本身 2） 固相的溶剂调整。 平衡的目的： 1) 除去多余的溶剂 2) 使固相的溶剂状态与样品一致 3) 为保留样品准备适当的环境。


样品前处理可分为一般液体处理和分离 提取：
A.一般液体处理 1.液体的转移 2.液体的稀释 3.液体的混合 4.标准物的添加

B.分离提取
1、液—液萃取法 2、蒸馏法 3、膜透析法 4、离心/过滤法 5、固相萃取法 6、微波法 7、超声波离心法 8、超临界液体萃取法 9、生物样品的特殊制备 10、 加速溶剂萃取法
正相型SPE小柱 硅胶 Al2O3 硅酸镁 醇基 氨基 等
从分离机制上分类
离子交换型SPE小柱 反相型SPE小柱 C18 阴离子交换小柱 阳离子交换小柱 tC18 tC2 羧丙基CBA 弱 -CN -NH2 氨丙基 苯磺酸SCX 强 C8 等
SAX 四基氨
Байду номын сангаас丙磺酸PRX
tC18:是三官能团的C18小柱，在酸 性条件下，C18集团不会水解下来， 特别适合与GC ,GC/MS 或 LC/MS 分析之前的样品处理。 tC2 三功能团的疏水性较弱的 C2小柱，适合用在环保制药等分析 领域的样品处理。
第六章 固相萃取技术(SPE) (Solid—phase Extraction)
§ 6—1 概述 § 6—2 固相萃取原理 § 6—3 固相萃取模式 § 6—4 固相萃取装置与分类 § 6—5 SPE柱的使用方法 § 6—6 SPE柱的应用范围 § 6—7 SPE柱的使用技术 § 6—8 应用
§ 6—1概述

从色谱分析的整个过程看（见 图），该统计发现在分析过程中样 品前处理产生的误差最大，高达 30%，如果再加上操作误差，人为 因素占了误差来源的近50%。 换句话来说，如果我们能够解 决人为因素造成的误差，分析误差 产生的几率就降低了一半，

由八十年代中期开始发展较快的一项样 品前处理技术是固相萃取法(solid phase extraction ,SPE ),又有人称之为固液萃取法 (solid liquid extraction,SLE)。 目前最常用的 是键合硅胶柱。 与传统液液萃取法（liquid- Liquid extraction,LLE）比较， SPE具有明显的优势 首先，在LLE中乳化是一种时常发生的现象。 萃取过程一旦发生乳化 ，将严重影响结果的 重现性，而SPE中则不存在这个问题。
在化学分析中和生物工程中，样品前 处理或净化是一亟待解决的问题。据统计 ，人们常常将60%的时间花在样品处理上 ，这不但不符合高效率的要求，繁琐的传 统样品处理方法也直接影响了最后的分析 结果。
从八十年代中期固相萃取技术 就开始在国外流行，并逐步取代了 传统的液—液萃取技术。经过多年 的发展，固相萃取技术在国内也越 来越引起人们的重视，固相萃取技 术在样品前处理中的角色也日益显 得重要。
§6-3 固相萃取的种类
为了操作方便，通常是把SPE用的吸附 剂按种类分别装在特制的塑料管中，形成不 同类别的SPE小柱供人们选用。 这些小柱不仅有满足不同样品应用的不 同吸附剂，而且每种类型还有不同吸附剂量 及不同形状的小柱，了解这些小柱的特点， 对于正确选择适合自己需要的小柱是十分重 要的。
一
例如欲分析红酒中的有机酸， 可采用SPE-pak C18小柱作样品预 处理，酒样中的色素等干扰物将 保留在小柱上，而极性较强的有 机酸不保留通过C18小柱。
但欲分析红酒中酚类物质我 们也可用 C18小柱，在这种情况 下，酒样中的极性组份（如糖、 有机酸）不保留，而多酚类物质 可保留在C18小柱上，再用较强 的流动相将多酚类物质洗出来。

固相萃取基本步骤示意图
固相萃取是靠固体填料上的键合 功能团与待分离化合物之间的作用力 将目标化合物与基液分离达到样品净 化浓缩的目的的。下面以固相萃取小 柱（手动操作）为例说明如下：
采用固相萃取小柱作样品预处理 的主要有两种方式。 其一，选择合适的小柱及溶剂使 感兴趣的组份保留在小柱上，而使干 扰母体不保留，通过小柱；当需要浓 缩或富集低浓度样品或者当感兴趣组 份浓度很低时，常使用这种方式。
C18
硅酸镁
氧化铝 A
§6—4 固相萃取小柱的应用范围
填料
氧化铝 B 氧化铝 N 氨基 腈基 醇基 ACCELLTM+QML ACCELLTM+CM
应用范围
碱性样品 阳离子交换— 糖、咖啡因 中性样品 —人造粗油 分、食品添加剂、 石油、 人造有机化合物 药品、石油、油渣 生理液中的药品、发酵产品中的代谢 物 、杀虫剂 水中微量组份、化妆品中的抗生素 碱性蛋白质和酶、 肽、饮料中的色素 碱性蛋白质和酶、 肽、合成有机成分
根据LC—GC 杂志对世界1000多个实验 室进行的统计，样品前处理所花费的时间占 整个分析过程的61%（见图），现代的自动 化分析仪器使分析工作变简单、快速。 然而，国内拥有现代化分析仪器的实验 室却依然是用着古老、繁琐的样品前处理方 法。可以说，样品前处理已经成为现代分析 中的瓶颈。严重阻碍了分析工作的进行。因 此，要提高效率，就必须解决样品前处理的 问题。
二、 反相机理在SPE小柱(C18\CN等)上的应用
逐渐增加洗脱强度洗出感兴趣的组分
1、用甲醇 水活化小柱 2、加样 3、洗脱 感兴趣的组分 4、组分1 5、组分2 6、弃去用过的小柱
反相机理应用示意图
三、离子交换机理在小柱上的 应用
逐渐增加洗脱强度洗出感兴趣的组分 1、 用 水或缓冲液活化小柱
§6—5 固相萃取小柱的使用技术
1、流速 使用SEP-pak小柱的流速应使在加样 及洗脱过程中不发生扩散及平衡不完全 的现象，一般来说，对正相或反相小柱 最高流速不超过25ml/min 。负载样品及 洗脱的最佳流速应小于10ml/min 。 对离子交换小柱，建议用1~2ml/min 的流速。
2、样品容量 每个小柱的负载样品量应根据小柱 的吸附剂类型、吸附剂量等因素来决定。 一般来说，典型的正相或反相小柱的最 大负载量不超过100毫升 ( 以最强保留物 质计算，而不是以感兴趣的组分计算)， 而离子交换小柱则根据填料的量及交换 容量计算负载量。
其二，是使感兴趣的组份不保留 通过小柱，使干扰母体保留在小柱上。 而当感兴趣的组份浓度较高时，通 常使用这种方式。

对以上两种方式主要可以选择一 下三种不同分离机理：正相、反相 和离子交换。而在每一种模式中有 许多不同的吸附剂。 分离机理、吸附剂和洗脱剂的 选择由样品的特点及想要达到的分 离目的决定。
目前在国际上，固相萃取技术 已广泛应用于医药、临床血中药物 浓度监测、刑事化验、检验检疫、 环保、食品、水质、领域中的样品 前处理，同时，在生物技术和生物 工程领域，人们也开始使用固相萃 取技术进行生物样品的纯化。而且 ，自动化固相萃取仪也越来越被广 泛应用。
在分析化学中样品前处理，是一个十分 重要的步骤，样品前处理得好坏直接影响最 终分析结果。而且还会影响分析仪器的使用 寿命。 许多分析化学工作者已经认识到样品前 处理的重要性，人们在不断研究，改进样品 前处理的方法，使之准确、快速、简单、有 效。
二、从形状上分类
1、SPE classic 小柱
传统的小型是最 早设计的结构简单， 一次成型，具有很高 的重现性 及柱效，是 使用最普遍的径流型 小柱。
2、SPE plus 小柱
这种小柱的设计 即可手工方式使用也 可接抽真空多通管， 注射器或放在样品自 动处理机上使用，其 填料量与SPE classic 小柱不相同，两者可 进行方法 转换
SPE使用的填充剂及样品容量参数值
§6—7固相萃取小柱的应用
一、尿样中可的松的处理 SPE C18小柱操作步骤 1、先进2毫升水，在将2毫升甲醇注入，使 小柱活化； 2、将2毫升尿样加入活化好的C18小柱中 3、加入2毫升甲醇/水（20+80）混合液，洗 去干扰物质 4、加入100%甲醇溶液，收集流出液， HPLC进样分析


SPE的基本原理和HPLC相同，但 目的则完全不同。HPLC是要在短时 间内将各个化合物分离并保持好的峰 形。 而SPE是要从复杂的基液中分离 人们感兴趣的化合物并将其浓缩，以 便进行进一步的分析。
因此，传统的SPE柱填料的颗粒 往往比HPLC柱的填料颗粒要大的多 (一般在40Ǻ)，而且是不规则的颗粒 以增加接触样品的表面积。 目前用 的最广泛的是键合硅胶柱（BONDED SILICA COLUNM),其次是聚合树脂 柱。
§6-2 固相萃取的基本原理
固相萃取（Solid Phase Extraction ,简 称SPE）是一个包括液相和固相的物理萃 取过程。在固相萃取过程中，固相对分析 物的吸附力大于样品基液。 但样品通过固相柱时，分析物被吸附 在固体填料表面，其它样品组份则通过柱 子。分析物可用适当溶剂洗脱下来。
其次， LLE的另一个主要缺点是回收率的 高低在很大程度上取决于操作人员对该技术掌握 的熟练程度，也就是说同样的一个方法，不同操 作者得到的结果可能差异很大，这将影响方法的 推广，也难以进行试验室的质量控制和标准化。 而SPE是基于分析功能团和固相填料功能团 之间的作用力将分析物萃取出来的，其萃取结果 稳定、方法很容易在实验室之间转移，有利于标 准化。