昆虫拒食剂毒力评价指标AFC_50_的不合理性_张志祥

昆虫拒食剂毒力评价指标AFC50的不合理性
张志祥1,3程东美2徐汉虹1,3
(1 农药与化学生物学教育部重点实验室 广州 510642;
2 仲恺农业技术学院植保系 广州 510225;
3 华南农业大学昆虫毒理研究室 广州 510642)
摘 要：AFC50是评价昆虫拒食剂拒食活性的中浓度，简称拒食中浓度。

拒食率随剂量的增加而增加不是必
然现象，同一处理时间下，拒食剂浓度与拒食率呈线性相关性，与剂量-死亡效应的S曲线有着本质的不同。

这些现象表明，LD-P-Line不能推广用于计算AFC50。

关键词：AFC50, LD-P-Line
IT IS UNREASONABLE THAT TOXICITY REGRESS EQUATION WAS
USED TO CACULATE AFC50
Zhang Zhixiang1,3 Cheng Dongmei2 Xu Hanhong1,3
(1 Key Lab. of Pesticide and Chemic Biology, Ministry of Education, Guangzhou, 510642;
2 Plant Protection Department, Zhongkai Agrotechnical. College, Guangzhou, 510225;
3 Lab. of Insect Toxicology, South China Agric.Univ.,Guangzhou, 510642)
Abstract: It is not necessary that antifeedant rate increases with dose increasing. Concentration of antifeedant insecticide and antifeedant rate are line correlation,which is different substantially with correlation of dose and mortality. Toxicity regress equation can’t be used to caculate AFC50.
Key words: AFC50, LD-P-Line
1 前言
目前，昆虫拒食剂是新农药研究的热点之一，特别是植物性农药的主要研究方向，许多植物源活性成份，如印楝素、川楝素(张志祥,2002)、茼蒿素(张志祥,2000)、闹羊花素—III(钟国华,2001)等均对多种害虫具有较好的拒食活性。

目前，国内采用的拒食活性毒力评价指标主要为拒食中浓度，即AFC50，本文认为，AFC50的统计分析存在理论缺陷。

自1927年Trevan提出致死中量(median lethal dose，LD50)以来，人们采用了多种方法来获得该值，如目测法、最小自乘法和机率值分析法等(张宗炳, 1988)。

随着剂量的增加，效应累积增加，剂量-效应的关系是不对称S形曲线(见图1)，较难从中读出准确的致死中量值，将剂量取对数，则剂量对数-效应关系呈对称的S曲线(见图2)，取图2 S 曲线中的死亡率为14~86%之间的一段，将死亡率转换为机率值，则将剂量对数-效应的S型曲线转变为剂量对数-机率值(LD-P-line)这一直线回归式(见图3)，这就是目前常用的计算致死中量的机率值分析法(吴文君, 1998)。

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图1 浓度与死亡率的关系 图2 浓度对数与死亡率之间的关系 图3 浓度对数与机率值的关系
LD-P-line 被推广应用于计算致死中浓度(LC 50)、有效中量(ED 50)、有效中浓度(EC 50)、击倒中时(KT 50)、忍受极限中浓度(TLm)和拒食中浓度(AFC 50)等一系列中浓度或中量上。

国内外广泛应用机率值分析法来计算AFC 50，然而，没有文献证明该算法是否合理。

LD-P-line 来源于剂量-死亡效应关系，AFC 50中的效应是拒食效应，由于拒食率和死亡率有着本质的不同，本文认为，不能简单地套用LD-P-line 来计算AFC 50。

2 拒食活性测定与结果统计
在拒食活性测定中，每重复1头虫，每处理10~30个重复(侯有明，2001； 罗都强，2001； 张国洲，2002； 程东美，2002)。

在拒食活性中，若将2头以上的试虫放在1个重复中，将影响该重复拒食率的准确性，通常处理后12h 、24h 或48h 调查试虫取食情况，在调查前，如果出现试虫死亡情况，就不能准确算出该重复平均取食率，因此，每重复只设1头虫。

算出各重复拒食率算术平均值即可得到平均拒食率。

将浓度取对数，拒食率取机率值，用机率值分析法求出毒力回归曲线，再求出AFC 50。

3 拒食效应与死亡效应的不同之处
虽然同是试虫对药剂的反应，但拒食效应与死亡效应有很大的不同。

死亡效应的特点:试虫之间相互独立，死亡的试虫不对未死亡的试虫产生影响；重复间相互平行，均代表整体；试虫死亡具有不可逆性，只存在死和活两种反应，必须先活后死；每重复的死亡率是群体的死亡率，该群体代表整体；剂量有累积作用，试虫的反应有积累效应。

拒食效应的特点：供试生物一直是活体试虫；在某浓度下，t 时间的拒食率对t+∆t 时间的拒食率有影响；每重复1头试虫，该重复不代表整体，重复间拒食率分布频率呈正态分布；群体的拒食率是由个体来反应；试虫有适应反应；由于饥饿，试虫的取食量可能增大。

剂量-死亡效应的S 曲线中有一明显特点，那就是随着剂量的增加，试虫死亡率相应增加，在死亡率为14~86%之间时，这种现象尤其明显，从本质上说，机率值分析法是以这种现象为基础的。

剂量与死亡效益的基础之一是试虫的死亡是不可逆的，即死了的试虫不可能活过来，在一定浓度下，随着时间的延长，作用于试虫的剂量提高，试虫死亡率增大。

因此，在剂量-死亡效应关系中，在某一处理下，试虫第2天的死亡率必然大于或等于第1天的死亡率。

0.7959
1.0969 1.3979 1.6989 1.9999
dosage
p r o b i
t
10203040506070809010005
10
1520
浓度死亡
率
10203040506070
80901000
5
101520
25
30
浓度对数
死亡率
拒食效应和死亡效应的本质不同在于试虫一直是活的，由于试虫没有死亡并且对药剂具有适应反应，这使得拒食效应可能出现逆反现象，即剂量提高了，拒食率反而下降了。

如果拒食率(14~86%之间)不随剂量的增加而增加，就违背了剂量与死亡效应中的效应积累增加现象，这也就丧失了计算AFC50的理论基础。

4 剂量-拒食效应的反常现象
从表面上看，拒食率应随剂量的增加而增加，但国内外的研究表明，这不是必然现象。

4.1 随着时间的延长和剂量的提高，拒食率降低
如果剂量-拒食效应符合剂量-死亡效应曲线，那么同一浓度处理第2天的拒食率应大于或等于第1天的拒食率，同一处理第2天的AFC50应小于第1天的AFC50。

但许多试验结果违反了这一规律。

1%紫茎泽兰花石油醚提取物对菜粉蝶4龄幼虫处理后24h、48h和72h的AFC50值分别为1909.5mg/L、2497mg/L、2234.9mg/L，在3750mg/L的浓度下，菜粉蝶幼虫处理后24h和48h的取食面积分别为174.4mm2(CK的为463.8mm2)和274.5mm2(CK的为659.0mm2)，而拒食率分别为62.45%和58.3%(周天雄等，2003)。

用100mg/l的闹羊花素-III处理菜粉蝶4龄幼虫，处理后24h和48h，拒食率分别为82.53%和59.55%(钟国华，1999)。

唐古特瑞香乙酸乙酯提取物处理菜粉蝶5龄幼虫,处理后24h和48h的拒食率分别为90.37%和87.17%（陈立，2000）， 12号茼蒿素类似物对小菜蛾3龄幼虫处理后的选择性AFC50分别为97.15mg/l和192.74mg/l (张志祥，2000)。

茶皂素对菜粉蝶3龄幼虫处理后12h和24h 的非选择性AFC50值分别为130.36mg/l和218.40mg/l (王小艺，1999)。

1%金腰箭叶甲醇提取物处理小菜蛾3龄幼虫，处理后24h和48h，拒食率分别为75.7%和73.8%(章玉苹，2000)。

1%金腰箭氯仿提取物处理菜粉蝶5龄幼虫，处理后24h和48h，取食面积分别为1.01cm2和6.10 cm2，拒食率却分别为79.2%和54.2%(章玉苹，2002)。

印楝素B对斜纹夜蛾3龄幼虫处理后24h 和48h选择性AFC50值分别为0.18mg/L和0.22mg/l，3mg/l印楝素A处理小菜蛾3龄幼虫，处理后24h和48h，拒食率分别为85.33%和83.57%(张志祥，2003)。

用9mg/l印楝素A浸渍处理菩提树(Tilia cordata L.)叶，晾干后连续4天饲喂日本金龟子(Popillia japonica)雌虫，刚开始金龟子取食受到明显抑制，但是处理3天，抑制作用明显下降(Held，2001)。

4.2 在同一处理时间下，随着剂量的提高，拒食率降低
在高浓度下，药剂具有较好的拒食活性，能强烈地抑制试虫取食，表现出高拒食率；在低浓度下，拒食率较低，由于取食量增大，剂量可能反而提高了。

印楝素对菜粉蝶幼虫具有非常好的拒食活性，用30mg/l印楝素A浸渍处理甘蓝叶，菜粉蝶幼虫的取食量近于零并且饥饿而死，而用0.2mg/l印楝素A处理，菜粉蝶幼虫却有较大量的取食，虽然前者印楝素含量较高，但后者作用于虫体的剂量更大(张志祥,2003)。

用1000mg/l和100mg/l的闹羊花素-III处理菜粉蝶4龄幼虫，处理后24h，平均取食面积分别为0.06cm2和0.76cm2，后者作用于虫体的剂量高于前者(0.76×100>0.06×1000)，但前者的拒食率高于后者，前者的为98.62%，而后者的为82.53%(钟国华，1999)。

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4.3 剂量-拒食效应反常现象导致的后果
由于剂量-拒食效应出现了反常现象，并违背了图1和图2中的效应累积增加现象，那么，剂量对数与拒食率机率值不能表现出LD-P-Line(见图3)的直线回归关系，也就是说丧失了计算AFC50的数学统计学基础。

4.4 拒食效应逆反现象原因分析
为什么会出现高剂量低拒食率的现象呢？这是由于起拒食作用的剂量不能累积和拒食效应不能累积引起的。

4.4.1 剂量的不累积性
在拒食活性测定，用药剂量对试虫的作用靶标不具有累积作用，这是拒食剂独特的作用机理决定的。

一般来说，触杀剂、胃毒剂或熏蒸剂等常规农药作用于试虫体内的某个组织和器官，如神经系统，药剂进入虫体后在虫体内累积，随着剂量的提高，对靶标的攻击概率就越大，表现出的生物活性也越强，因此，在毒杀活性测定中，药剂具有累积作用。

而拒食剂主要作用于试虫的味觉感受器，影响的是试虫的口感，药剂通过口器或接触口器时对试虫有拒食活性，而药剂进入试虫体内就不再对味觉感受器有影响，药剂在虫体内积累了，但失去了起拒食作用的靶标，也就失去了它们应有的拒食作用。

如处理后24h，试虫体内积累了50µg药剂，试虫的口器正在接触2µg药剂，起拒食作用的是试虫正在接触的2µg药剂，而不是总共的52µg 药剂；如果是死亡效应，起毒杀作用的是积累在虫体内的50µg药剂。

4.4.2 拒食效应的不累积性
在拒食反应中，试虫是活的，而活的试虫对药剂是有适应能力的，经过1~3天的取食适应，药剂的耐药性可能提高，或经过长一段时间拒食引起的饥饿，试虫的取食量不减反增，这都可能导致拒食率随剂量的增加而下降。

拒食剂的特点：明显抑制昆虫的取食，用药3~6天后出现明显的死虫现象。

害虫的取食量随着浓度的增加而逐渐减少，在较高浓度下(如1000µg/ml川楝素)，害虫只在叶片边缘咬出微小的缺刻，以后试虫则完全不取食，直至饥饿而死。

在较低浓度下(如250µg/ml川楝素)，取食较少，随着饥饿时间的延长，害虫的取食量才逐渐加大，试虫少量多次取食(张兴，1992；张志祥，2002)。

在拒食剂较低浓度下，试虫少量多次的取食，从这里可以看出，拒食剂对味觉感受器上靶标的攻击结合是可逆的，试虫在停止取食一段时间后，拒食剂脱离靶标部位，试虫口器从不适感中恢复过来，又再次取食，由于前次取食的拒食剂离开了作用靶标，后一次取食的拒食剂造成的拒食反应不能与前次效应累加。

这与人对甜味剂或苦味剂的口感相似，人取食黄莲后一段时间，苦味将消失，再次取食的时候，不会觉得比上次取食更苦。

因此，随着剂量的增加，拒食效应不一定积累。

5 同时处理，同时调查，浓度与拒食率的关系
以上内容对剂量-拒食效应的反常现象进行了总结及分析，从拒食剂的作用机理和实践试验等方面来论述了计算AFC50时出现的问题，并认为拒食效应不具备剂量-死亡效应的基本特征，因此不能用LD-P-line来计算AFC50。

不过，同时处理，同时调查取食情况，浓度与拒食率的关系不出现这种逆反现象，不同试虫对药剂的拒食敏感性或抗性分布也是呈正态分
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布的，在这种性况下，能不能用毒力回归方程来计算AFC50呢?
本文认为，这也是不合理的。

5.1 拒食率分布频率不是正态分布函数
死亡率分布频率是正态分布函数，是指增加单位剂量导致死亡率的增加量。

死亡率是整体效应，是死亡的试虫数占试虫总数的百分比，死亡率的增加是由对药剂耐药性呈正态分布的抗性更高的部分试虫的死亡引起的，因此，死亡率分布频率呈正态分布。

不同试虫对拒食剂的耐药性呈正态分布，然而，拒食率测定的是活虫的拒食反应，在测定中，所有试虫均起反应，拒食率的增加不是由抗性试虫的反应引起的，而是由被拒食剂攻击的靶标数增加引起的。

在个体试虫内，不同靶标位点与拒食剂的结合能力呈正态分布。

以单位剂量攻击的靶标位点数为一个靶标单位，一个靶标单位含有众多靶标位点，从生物统计学上看，各靶标单位之间的性质是均一的，即各靶标单位对拒食剂的反应是一样的。

增加单位剂量引起单位靶标位点数起反应，既然各靶标单位与拒食剂的结合能力没有差异，那么拒食率分布频率不呈正态分布。

拒食率分布频率不象死亡率分布频率呈正态分布，因此，拒食剂浓度-拒食效应的关系与图1中表现的剂量-效应曲线不同。

5.2 浓度与拒食率应呈线性相关
既然拒食剂浓度-拒食效应关系不呈图1中的S曲线，那么,它们之间应该是什么关系呢?
本文认为，拒食剂浓度-拒食率之间应呈线性相关性。

对个体试虫而言，拒食率的增加与被攻击靶标位点数的增加呈正比，而被攻击的靶标位点数与作用于受体的浓度呈正比，因此，拒食率应与拒食剂浓度呈正比。

即：y=a+bx.................................................................. . (1)
y为拒食率，x为浓度，a为常数，b为斜率。

设有n个试虫，则每个试虫的拒食率与拒食剂浓度关系为：
y1=a1+b1x，y2=a2+b2x，y3=a3+b3x，⋅⋅⋅，y n=a n+b n x (2)
dy1=b1dx，dy2= b2dx，dy3= b3dx，⋅⋅⋅，dy n=b n dx (3)
dx为拒食剂浓度增加量，dy i为第i个试虫拒食率增加量。

那么：y1+y2+y3+⋅⋅⋅⋅⋅y n= (a1+ a2+ a3+⋅⋅⋅+a n) +(b1+b2+b3+⋅⋅⋅+b n)x (4)
dy1+dy2+dy3+⋅⋅⋅+dy n=(b1+b2+b3+⋅⋅⋅+b n)dx=dy1，2，3...n=kdx.. (5)
dy i为n个试虫拒食率总体增加量。

从方程(5)可以看出，n个试虫总体拒食率增加与拒食剂浓度增加呈正比，即群体拒食率分布频率不呈正态分布，而呈线性分布。

5.3 拒食剂浓度与拒食率线性相关性证据
有许多报导的试验数据表明拒食剂浓度与拒食率呈线性相关，有些文献报道药剂浓度与试虫反应(或靶标反应)具有良好的线性相关性。

5.3.1 拒食剂浓度与拒食率线性相关性
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许多文献报道的试验数据表明，拒食剂浓度与拒食率的线性相关性高于浓度对数与拒食率机率值的线性相关性。

如500mg/l、250 mg/l、125 mg/l和2.5 mg/l茶皂素对菜粉蝶5龄幼虫24h后的拒食率分别为90.29%、74.20%、66.30%和61.96%(王小艺，1999)，浓度与拒食率的直线相关系数为0.99995，而浓度对数与拒食率机率值的直线相关系数为0.9338。

10000mg/l、5000mg/l、2500mg/l和1250mg/l的SLME对小菜蛾3龄幼虫处理后24h的非选择性拒食率分别为86.48%、65.72%、51.26%、45.45% (章玉苹,2001)，浓度与拒食率的直线相关系数为分别为0.9940，而浓度对数与拒食率机率值的线性相关系数为0.9694。

5.3.2 药剂浓度与试虫反应(或靶标反应)线性相关性
与测定拒食活性相似，测定药剂对试虫靶标的影响时，试虫在调查结果前一直是活体试虫，因此，药剂对试虫体内靶标(如酶、蛋白质、血糖等)的影响与拒食剂对感受器靶标的影响的性质相似。

许多研究表明，药剂浓度与药剂对试虫体内靶标的影响呈直线相关。

10µg/头、5µg/头、3µg/头和1µg/头的闹羊花素-III处理菜粉蝶龄幼虫，处理后24h，试虫血淋巴降低率为58.77%、48.62%、43.53%和39.57%，药剂浓度与血淋巴降低率的线性相关系数为0.9992；处理后60h，肌肉海藻糖的含量分别为18.38mmol/l、15.91mmol/l、16.99mmol/l和18.03mmol/l，药剂浓度与肌肉海藻糖浓度的线性相关系数为0.9885(钟国华, 2001)。

在测定多炔类化合物的不同剂量对亚洲玉米螟5龄幼虫栓锥感受器诱发脉冲振幅中，浓度与栓锥感受器振幅(µV)具有良好的相关性，No.9化合物的浓度为1000mg/l、500 mg/l、250 mg/l、125 mg/l、62.25 mg/l时，振幅分别为925µV、650µV、566µV、500µV和450µV，浓度与振幅的线性相关系数为0.9964。

起拒食作用的感受器上细胞的脉冲振幅与拒食活性呈直线相关性(万树青,2001)。

EAG反应相对值反应的是药剂对试虫触角电位的影响，反应的是试虫的忌避活性，与药剂对试虫的生物活性具有较好的线性相关性。

通过对已有文献的EAG反应相对值与药物浓度的关系进行分析，发现药物浓度与EAG反应相对值的线性相关性优于浓度对数与EAG反应相对值(或浓度对数与EAG反应相对值机率值)的线性相关性，该比较数据见表1。

表1 烟青虫对挥发性次生物质EAG反应相对值与次生物质浓度的关系
EAG反应相对值(1)相关系数
处理
10-5(2)10-4(2)10-3(2)10-2(2)10-1(3)浓度对数-EAG浓度对数-EAG机率值浓度- EAG 顺-3-已烯-1-醇 18.98 20.93 33.88 55.7693.450.9375 0.9224 0.9202 1-庚醇 24.62 25.84 25.78 42.0385.140.8385 0.8364 0.9826 1-已醇 19.81 23.09 33.05 56.93102.94(3)0.9197 0.8187 0.9415反-2-已烯-1-醇 28.32 22.7 34.49 51.8796.090.8768 0.8482 0.9589反-2-已烯-1-醛 23.42 25.85 28.34 40.3078.700.8613 0.8671 0.9814
281
1-辛烯-3-醇 24.33 23.24 24.52 50.9587.750.8718 0.8648 0.9449
顺-3-已烯已醇
酯 24.03 25.11 27.20 40.2469.360.8746 0.8833
0.9685
注: (1)该数据见李捷(2000)文献; (2) 该数据为体积比浓度; (3) 该数据的机率值按接近100%的机率值计。

从表1中可以看出，药物浓度与EAG反应相对值的线性相关性较好，顺-3-已烯-1-醇的三个相关系数变化不大，其它6种次生物物质的浓度-EAG线性相关系数均高于浓度对数-EAG(或浓
度对数-EAG机率值)线性相关性。

因为EAG反应相对值与忌避活性具有良好的线性相关性，用药物浓度与生物活性具有较好的线性相关性。

5.4 小结
综上所述，拒食剂浓度与被攻击的味觉感受器靶标位点数呈正比，与拒食率直线相关，拒食剂浓度-拒食率关系不符合图1中的剂量-死亡效应的S曲线，不能用LD-P-Line来计算AFC50。

6 总结与讨论
拒食率随剂量的增加而增加不是必然现象，随着时间的延长和剂量的提高，拒食率可能降低，在同一处理时间下，随着剂量的提高，拒食率可能降低。

同时处理，同时调查取食情况，浓度与拒食率的关系不出现这种反常现象，但是浓度与拒食率的关系与剂量-死亡效应的S曲线不同，拒食剂浓度与拒食率呈线性相关性。

这些现象表明，AFC50不具备象LD50那样的数学统计基础，即LD-P-Line不能推广用于计算AFC50。

在植物化学保护和农药学领域，AFC50已是一种重要的毒力评价指标，许多农药具有较好的拒食活性，如印楝素、川楝素和茼蒿素等，它们之间的拒食活性常用AFC50进行比较，由于AFC50不具备常规毒力回归的数学统计基础，将给生物活性测定带来较大的影响。

参 考 文 献
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徐俊光　杜昱光　韩秀文　
（中科院大连化学物理研究所１８０５组）　
摘 要：壳寡糖不是底物却可以抑制辣椒疫霉β－１，３－葡聚糖水解酶的活性。

并且来源于Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｓｐ　的ｅｎｄｏβ－１，３　（４）－　ｇｌｕｃａｎａｓｅ可以大大补偿辣椒疫霉受到壳寡糖的抑制，而其活性不受壳寡糖的影响。

β－１，３－葡聚糖水解酶是壳寡糖直接抑菌作用的靶点之一。

　
前期实验表明，壳寡糖对植物病原真菌中的辣椒疫霉的抑制效果很好，且壳寡糖处理后，超微结构显示其菌丝尖端出现管状的类似细胞壁的物质，表明细胞壁是壳寡糖作用的靶标之一。

已有的生化和超微结构的研究都表明，壳寡糖的抑菌主要原因可能是使菌体细胞膜功能的丧失和菌体细胞壁的破坏。

而这两者之间的是否存在主次和先后关系仍需实验加以验证。

β-1,3-葡聚糖是卵菌纲真菌细胞壁的主要成分。

真菌孢子的萌发，菌丝生长，分枝，产孢，交配等过程均需要其水解与合成。

除此之外水溶性β-1,3-glucan 还是卵菌主要的能源贮藏物，贮藏在液泡中，而其它种类真菌为糖原。

因此催化β-1,3-葡聚糖水解和合成的酶对卵菌的生长和发育具有十分重要的作用。

本文以辣椒疫霉为对象考察了壳寡糖对其β-1,3-葡聚糖水解酶的影响，以加深对壳寡糖抑菌机理的认识。

１ 材料与方法　
１．１　供试菌种和试剂　
辣椒疫病菌(Phytophthora capsici)由西北农林科技大学植保所提供，于PDA上室温下培养保存。

壳寡糖本室自制，聚合度为2-15，用二菌的
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