流感的相关知识及实验室检测

红细胞凝集抑制（HI）试验
HA试验完成后，用国家流感中心每年提供的抗A（H1N1）、抗A （ H3N2 ）、抗 B （ Victoria 系）和抗 B （ Yamagata 系） 4 种标准 参照血清，进行红细胞凝集抑制（HI）试验，确定病毒的型别 和亚型，进行HI试验时，需同时进行4种标准抗原对照。
流感病毒胶体金抗原快速检测阳性检出率17.6%；核酸检测阳 性检出率为 31.0%；
参考文献 李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC
标本例 阳性例数 数 2017年 金标法 FLUA FLUB 核酸检 FLUA 测 FLUB 2018年 金标法 FLUA 1-4月 FLUB FLUA 200 7607 1163 12738 1393 697 41 16 90 1620 5 12
50ulPBS 操作简图 100ul病毒液 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 50ul 稀释病 50ul 50ul 50ul 50ul 毒
加入配 制好的 红细胞 悬液 充分混 匀，置 室温孵 育3060分钟 观察记 录结果
A B C
D
E
F
G H
稀释完病毒液后加入50ul红细胞悬液
流感的相关知识及实验室检测
陈宪楷
2018.5.24
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流感的相关知识回顾
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流感病毒
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流感病毒的实验室检测
流感病毒亚型的鉴定
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实验室检测的相关影响因素分析
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流感的相关知识回顾
流感是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。
人类的流行性感冒病毒(influenza,简称流感）， 属正粘液病毒科，分 A（甲）、 B（乙）、C（丙） 三型，呈球形或丝状，是一种造成人类及动物患 流行性感冒的负链RNA病毒。
参考文献 李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC 张杰 ，武晶晶 等.不同温度和不同放置时间对总RNA提取浓度和纯度的影响[J] 实验技术与管理.2013,11
我国流感流行现状及亚型
根据国家流感中心报道，今年监测到的流感病毒以甲型H1N1亚 型和乙型（Yamagata）系为主，并且总体上甲型H1N1亚型的比 例超过B（Yamagata）系。甲型H3N2亚型和B（Victoria）系以 低水平共同流行。 不仅在中国，在欧洲一些国家和地区，今冬流行的流感病毒 优势毒株是B型（Yamagata），这一毒株沉寂已久，普通人群 对它的免疫基本缺失
流感病毒的基因组
RNA与NP构成RNP 基因组由8个短的单链 RNA构成，包含11个基因，编码11个蛋白： 血凝素(HA), 神经氨酸酶(NA),核蛋白(NP), M1, M2，NS1, NS2（ NEP：核输出蛋白），PA, PB1（聚合酶基团1), PB1-F2和 PB2。
NP（核蛋白）和MP基质蛋白(M1)抗原性稳定，具有型特异性， 将流感分 A（甲）、 B（乙）、 c（丙）三型
红细胞 适用范围 终 浓 度 （％） 孔底部形 状 孵育时间 细胞对照
鸡 流感和禽流 感病毒 0.5（1%）
火鸡 流感和禽 流感病毒
豚鼠 流感病毒
人O型血红 细胞 流感病毒
马 禽流感病毒
U或V型
30min 细胞沉积成 圆点状，倾 斜时细胞向 下流成泪滴 状
0.5 （ 1% ） 0.75 （ 1.5% ） 0.75 （ 1.5% ） 0.5（1%） /0.5（1%） /0.5（1%） U或V型 U型 U型 U型 30min 45min 细胞沉积 细胞沉积成 成 圆 点 状 ， 环状 倾斜时细 胞向下流 成泪滴状 45min 细胞沉积成 环状 60min 细胞沉积成 环状
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病 毒 原 1:2 液
1:128 HA: 32
HA＞128 HA:4
红细胞凝集试验（HA）结果判读
HA滴度≥8，进行红细胞凝集抑制（HI）试验；
HA滴度<8者，继续在敏感的MDCK细胞系或鸡胚上进行传代 培养，使其HA滴度≥8后，再进行HI测定
若传1～2代后，HA滴度仍<8者，可应用核酸检测方法进 行鉴定
感染流感的一般临床表现：
流感一般急性起病，主要表现为发热( 可达 39-40℃) ， 伴畏寒、寒战、头痛、肌肉关节酸痛、极度乏力、食 欲减退等全身症状，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流 涕，也可有呕吐、腹泻等症状。
一般来讲，流感全身症状比普通感冒重。流感为自 限性疾病，发病3-4天后体温逐渐消退，全身症状 好转。重症病例可导致慢性基础病加重，也可出现 病毒性肺炎、心脏和神经系统损伤等并发症。
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流感病毒的实验室检测
流感病毒的实验室检测
实验前处理
流感标本采集 采集时间：病人发病的头3天内采集，最好是24h内
采集标本类型： 常规 咽拭子 鼻拭子

特殊 鼻咽/呼吸道吸取物 鼻洗液、含漱液 呼吸道灌洗液
血清
咽拭子采集

咽拭子 用灭菌棉签（最好用聚丙烯纤维头的塑料杆拭子）擦拭双 侧咽扁桃体及咽后壁，将棉签头部浸入含 3-4ml 采集液的 管中，尾部弃去，旋紧管盖。 注意：采样前1h内不要进食和饮水，采样液中严禁加入抗 生素
参考文献 李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC
标本采集时间的选择
从标本采集时间上分析，有文献报道，发病后 2d 就诊的流 感样病例，流感病毒阳性检出率明显高于其他各组，发热 4 天后就诊患者流感病毒阳性检出率最低，随着病程的延长， 咽拭子病毒核酸的检出率呈下降趋势
致病性强 哺乳类动物（猪，鲸鱼，
马 ， 海 豹 和 猫） 或 禽 类 都会被广泛感染 容易发生突发性变异， 从 而 引 起 普 遍性 流 感 ， 世界性大流行
以散在形式出现， 主要侵袭婴幼儿， 乙型 流感 一般不引起流行。
甲型 流感
只 会 感 染 人 类 和
丙型 流感
海豹 有 限 的 宿 主 导 致 不会发生重大突变 ， 呈局限性流行
图. 中国流感病毒检出率及其亚型分布
流感的季节性流行
流感病毒在我国的活动规律南北存在明显的差异。 高峰期 冬春季 夏季
冬春季
长江以南
长江以北
流感的流行病学
1.流感患者 2.隐性感染 者 1.近距离飞 沫传播 2.接触传播
传染源
传播途径 病毒变异快
反复感染 并发症
65岁以上老年人、 婴幼儿、 慢性病患者
50ul PBS
H1 H3 血清 血清 50ul 50ul
B 血清 50ul
操作简图 恢复期
25ul 25ul 25ul
25ul 25ul PBS
25ul 25ul 25ul
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流感病毒的型别判定
标准参照血清对待鉴定病毒的抑制效价≥20才可以算为阳 性
一个待鉴定病毒不能同时被两种或两种以上的标准血清 抑制
因此对于高危人群，应在发病后尽早采 样，必要时可采用多部位、多次取样检 测,以提高流感病毒阳性检出率
参考文献 李珺，刘亚楠，田国保等.临床实验室流感病毒检测的相关影响因素分析[J].国际病毒学杂志,2017，24（5）：331-335 ISTIC
检测方法的选择
有研究对流感病毒胶体金抗原快速检测法与核酸 PCR 法比较， 两者之间一致性较差。以咽拭子流感病毒核酸检测为标准， 流感病毒抗原快速检测法（胶体金法）的敏感性和特异性分 别为 27.6% 和 86.9%，其敏感性明显低于国内外文献报道的 水平（40%-85%）；
02
03
用灭活的抗原进行血清学检测时可以在 03 生物安全Ⅰ级实验室进行
常见的流感病毒实验室检测方法
检测方法 分子诊断 （RT-PCR）
灵敏度 高
特异性 高
优点 病毒含量低的 标本检出率高， 耗时短
缺点
培养法 低 （细胞培养法、 鸡胚培养法）
高
在分子生物学 阳性检出率低， 问世前，一直 漏检率高，耗 是流感实验室 时长，技术要 诊断的金标准， 求高 至今仍不可取 代 操作简单，耗 时短，不需仪 器设备，适用 于快速筛查 存在假阴性， 漏检率高，只 能鉴定出流感 病毒A、B型， 不能进行亚型 鉴定

我院进行流感核酸检测的病人大多是儿科具有呼吸系统疾 病的儿童，医生主要用于排除诊断
核酸检测的检测样本例数远远小于金标法

其他因素
1 体温
2 3 标本储存温度
- 有研究发现：年龄 >60 岁、体温在 38.0℃ ~38.9℃之间， 流感病毒阳性检出率高于其他组；
- 有文献报道：不同的放置时间和温度会影响RNA提取的质 量浓度，但对RNA纯度和完整性无明显影响。
待鉴定病毒与标准参照血清有交叉抑制，但与一种标准 参照血清抑制效价大于其他参照血清4倍以上时，可以判 定为此型别的流感病毒
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实验室检测的相关影响因素分析
约60%-70%不准确的检验结果产生于分析前阶段
做好分析前的质量控制是保证检 测结果准确可靠的先决条件
影响流感病毒检测的因素也大多出现在分析前
影响流感检出率的因素
流感病毒亚型的鉴定
1 红细胞凝集试验
2 红细胞凝集抑制试验
流感病毒亚型的鉴定流程
红细胞凝集试验
4个凝集单位配制“回滴”
红细胞凝集抑制试验
判定流感病毒型别
红细胞凝集试验（HA）
MDCK细胞或鸡胚收获的标本分离物首先用鸡、豚鼠或人红细胞 进行红细胞凝集试验（HA），确定病毒滴度
原理：流感病毒颗粒表面的血凝素蛋白（HA）含有能结合并 识别红细胞表面含唾液酸的糖蛋白或脂蛋白结构，许多哺乳动 物和禽的红细胞表面均含有这两种成分。因此流感病毒能与其 结合并识别，产生凝集现象。当血清中有特异性抗体与病毒血 凝素结合后，可以抑制凝集现象出现
甲乙型流感主要亚型
血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原结构极易发生变异，有亚 型的特异性，是甲型流感病毒分亚型的主要依据,甲型流感 命名通常会遵照 HN的规则命名，H代表血凝素，可分为16个 亚型；N代表神经氨酸酶，有9个亚型。会季节性在人群中出 现的亚型通常为H1，2和3，以及N1和2
根据乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征主要分为B型 (Yamagata)和B型(Victoria).
阳性率 10.9%
合计 16.4%
文献报 道
17.6%
5.5%
3.5% 1.4% 1.2% 21.3% 2.5% 6% 8.5% 22.5% 4.9%
31%
核酸检 测 FLUB
我科2017年和2018年1-4月流感阳性率统计
导致我科流感核酸检测检出率与文献报道不符的原因分析？

文献报道筛选的病人是高度怀疑流感病人，用于进行方法 学比对试验，与我们的统计人群无可比性
红细胞凝集抑制试验步骤
4个凝集单位的配 单位抗原，室温孵 制和检测 育15-30分钟
加入25ul 4个血凝
观察记录结果
稀释血清
每孔加入50ul红细胞 悬液，充分摇匀。室 温孵育30-60分钟
红细胞凝集抑制试验稀释血清
急性期 病 毒 液
25ul
H1 血清 50ul
H3 血清 50ul
B 血清 50ul

标本的处理和保存
标本采集后应立即放入适当的采样液中低温保存，常用的采样 液有：PH 7.4-7.6的Hank’s液或MEM 标本应在4℃保存24小时内送至实验室，实验室对收到的标本最 好24～48小时内进行检测或接种。 如不能在48h内检测或接种，标本应置于-70℃保存
实验室生物安全要求
01 季节性流感病毒分离鉴定在生物安全Ⅱ 级实验室进行。 流感病毒分离鉴定及其它检测过程中所有能 够产生感染性气溶胶的过程必须在生物安全 Ⅱ级实验室的生物安全柜里操作。
快速试纸条法 （金标法）
较低
较高
血清学检测
（血凝抑制试 验）
高
高
能够鉴定亚型
要求急性期和 恢复期双份血 清，对于季节 性流感仅限于 流行病学调查 及回顾性诊断
季节性流感检测流程
临床标本采集 流感病毒核酸检测阳性 接种MDCK细胞 接种鸡胚
红细胞凝集试验
PCR鉴定
红细胞凝集抑制试验，鉴定病毒
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流感病毒亚型的鉴定
采样部位的选择
标本采集时间的选择
检测方法的选择
其他因素
采样部位的选择
就不同采样部位而言，国内外关于采样部位的研究主要集中 在鼻拭子、咽拭子和下呼吸道吸取物， 一般认为鼻拭子因 含有较多呼吸道上皮细胞导致流感病毒检出率高于咽拭子
标本采集后获取的呼吸道上皮细胞含量决定着采样质量；而有研 究提示，不同型别的流感病毒对于定居部位有着一定的嗜性，虽 然都是入侵呼吸道上皮细胞，但是选择的部位可能有所不同，导 致不同型别的流感病毒在不同的采样部位检出率不同