肌氨酸氧化酶的酶学性质及失活机理
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５ ０ ｍＬ含 Ｋ ａ ｎ的 Ｌ Ｂ液 体培 养基 ， 于３ ７ ｃ Ｃ， ２ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ
振 荡过 夜 。按 体积 分 数 ５ ％ 的接种 量 转 接 于 ５ ０ ｍＬ
列 梯 度范 围内保 温 １ ０ ｍｉ ｎ ， 测定 其对 应 的剩 余 酶 活
力， 以观察酶 的热 稳定 性 。另 外 。 将 一定 量 的酶液 分
仝艳 军 ． 等： 肌 氨 酸 氧 化 酶 的 酶 学 性 质 及 失 活机 理
粒 进行 鉴定 。
１ 个 酶 活单位 （ Ｕ） 。
１ ． ７ 重组 肌氨 酸氧化 酶 的纯化 及 酶学性 质
１ ． ７ ． １ 肌 氨 酸 氧 化 酶 的 纯 化 从 固体 平 板 挑 取 单 菌落， 接 人种 子培 养基 ， ３ ７℃培养 过夜 。 按 照体 积分
１ ． ７ ． ３ 酶 的热稳 定 性 和 ｐ Ｈ 稳 定 性 分 析 在 Ｄ Ｈ ８ ． Ｏ 、 ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ — Ｈ Ｃ １ 缓 冲液 体 系 中 ， ０ — ８ ０℃ 系
１ － ５ 重组 质粒 在 Ｅ ｃ ｏ ｌ ｉ 中的诱 导表 达
挑 取 阳 性 Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ 重 组 转 化 子 单 菌 落 接 种 于
（ ｐ Ｈ １ ０ ． ０ － １ １ ． ０ ） 。
图 １ 重 组 表 达 载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ ａ － ｓ ｏ ｘ的 构 建 流 程
Ｆｉ ｇ ． １ Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｓ ｐ ＥＴ２ ８ ａ － ｓ ｏ ｘ
百度文库
度为 ２ ． ０ 、 ２ ０ 、 １ ０ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ ，分别 混 匀在 ３ ７℃水 浴 中 保温 ２ ． ５ ｈ ， 测 定各 组 酶活力 。以未 加入 金属 离子 的 酶液 的活性 为 １ ０ ０ ％， 计 算 各组 的相对 酶 活力 ， 以观
察金 属离 子对 酶活 性 的影 响 。
以肌氨 酸 为底 物 ， 参 照文 献 方法 测 定［ １ ３ １ ． 取
５ ０ Ｌ不 同浓 度 的 Ｓ Ｏ Ｘ酶 液 ，分别 加 入 ３ ｍ Ｌ显 色
１ ． ７ ． ５ Ｓ Ｏ Ｘ 酶 动 力 学 参 数 的 测 定 用 ｐ Ｈ ８ ． ０的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ 缓 冲液配制浓度分别 为 １ ． ０ 、 ２ ． ０ 、 ３ ． ０ 、 ４ ． ０ 、 ５ ． ０ 、 ６ ． ０ 、 ７ ． ０ 、 ８ ． ０ 、 ９ ． ０ 、 １ ０ ． ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的肌 氨 酸 溶 液 。 于
照 文献 ［ １ ４ １ ， 纯化后 的酶液 置于 ４℃保存 备用 。
ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｓ Ｏ Ｘ （ １ １ ６ ４ ｂ ｐ ）
１ ． ７ ． ２ 酶 的 最适反 应 温度 和 最适 ｐ Ｈ 值 的测 定
在
ｐ Ｈ ８ ． ０ 、 ２ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ 缓 冲液 体 系 中 ，在 ２ ０ ～ ８ ０℃范 围 内测 定 不 同温度 下 的酶 活 力 ， 观察温 度 对 酶 活性 的影 响 ． 以 确定 酶 的最 适 反 应 温 度 ： 在不 同 ｐ Ｈ的反 应体 系 （ ｐ Ｈ ４ ． ０ ～ ｌ １ ． Ｏ ） 中测 定 Ｓ Ｏ Ｘ 的酶 活 力． 以酶 活力 最 高 的记 为 １ ０ ０ ％， 计算其他 ｐ Ｈ 条 件 下 的相 对酶 活 力 ，确 定 酶促 反 应 的 最适 ｐ Ｈ。不 同
别 置 于一 系列 不 同 ｐ Ｈ 的缓 冲液 中 ． ３ ７℃放置 ２ ． ５ ｈ
含 Ｋａ ｎ的 Ｌ Ｂ液 体 培养 基 中 ．于 ３ ７ ｃ Ｉ 二 ２ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ振 荡 至菌 体浓 度 Ｏ Ｄ 鲫 约为 ０ ． ６ — ０ ． ８ ， 加入 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ达 到终 浓度为 １ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ进行诱导 ， 继续培养 ８ ｈ 。 ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ，
ｐ Ｈ的缓冲液体 系为柠檬酸一 柠檬酸钠缓 冲液 （ ｐ Ｈ ４ ． Ｏ 一 ５ ． Ｏ ） ，磷 酸 一 磷酸 钾 缓 冲液 （ ｐ Ｈ ６ ． ０ ～ ７ ． ０ ） ， Ｔ ｒ ｉ ｓ —
ｐ ＢＲ ３ ２ ２ ｏ ｒ ｌ
Ｈ Ｃ １ 缓冲液 （ ｐ Ｈ ８ ． ０ ～ ９ ． ０ ） ， 碳酸氢钠一 Ｎ ａ Ｏ Ｈ 缓 冲液
数 ５ ％的 接 种 量 接 入 发 酵 培 养 基 ， ３ ７℃ ， ２ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ 培 养至 Ｏ Ｄ ６ ０ ０ ０ ． ６ ～ ０ ． ８后 ，采 用 １ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱
导８ ｈ 。菌 液破 壁 离心 后 。 取 酶上 清 液进 行 纯 化 ， 参
Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶 电泳 鉴定 。
１ ． ６ 肌 氨 酸 氧 化 酶 酶 活 测 定
应 体 系 中分 别 加 入 不 同 的 金 属 离 子 Ｎ ａ 、 Ｋ 、 Ｃ ａ 、
Ｍｇ ２ ￣ ， ＭＲ ２ ＋Ｆ ｅ ３ ＋ 、 Ｃ ｏ 、 Ｃ ｕ 和 Ｚ ｎ ２ ＋ ， 设 置 ３个 终浓 度 梯
后， 测 定其 对 应 的剩余 酶 活力 ， 以观察 酶 的 ｐ Ｈ稳 定 性 。不 同 ｐ Ｈ 的缓 冲液体 系 同 １ ． ７ ． ２ 。
１ ． ７ ． ４ 金 属 离子 对 酶 活 力影 响 的 测 定 在 不 同 反
４℃离 心 ５ ｍｉ ｎ收 集菌 体 ，用 ２ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ｐ Ｈ ８ ． ０的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ 缓 冲 液洗 涤 悬 浮 菌体 ， 冰 水浴 超 声 破 碎菌 体， 获 得待 测酶 液 。同时 以不加 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导 的重 组 菌 和 一个经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导 的 非 重 组 菌 作 为 对 照 ，进 行
振 荡过 夜 。按 体积 分 数 ５ ％ 的接种 量 转 接 于 ５ ０ ｍＬ
列 梯 度范 围内保 温 １ ０ ｍｉ ｎ ， 测定 其对 应 的剩 余 酶 活
力， 以观察酶 的热 稳定 性 。另 外 。 将 一定 量 的酶液 分
仝艳 军 ． 等： 肌 氨 酸 氧 化 酶 的 酶 学 性 质 及 失 活机 理
粒 进行 鉴定 。
１ 个 酶 活单位 （ Ｕ） 。
１ ． ７ 重组 肌氨 酸氧化 酶 的纯化 及 酶学性 质
１ ． ７ ． １ 肌 氨 酸 氧 化 酶 的 纯 化 从 固体 平 板 挑 取 单 菌落， 接 人种 子培 养基 ， ３ ７℃培养 过夜 。 按 照体 积分
１ ． ７ ． ３ 酶 的热稳 定 性 和 ｐ Ｈ 稳 定 性 分 析 在 Ｄ Ｈ ８ ． Ｏ 、 ２ ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ — Ｈ Ｃ １ 缓 冲液 体 系 中 ， ０ — ８ ０℃ 系
１ － ５ 重组 质粒 在 Ｅ ｃ ｏ ｌ ｉ 中的诱 导表 达
挑 取 阳 性 Ｅ． ｃ ｏ ｌ ｉ 重 组 转 化 子 单 菌 落 接 种 于
（ ｐ Ｈ １ ０ ． ０ － １ １ ． ０ ） 。
图 １ 重 组 表 达 载体 ｐ Ｅ Ｔ ２ ８ ａ － ｓ ｏ ｘ的 构 建 流 程
Ｆｉ ｇ ． １ Ｃｏ ｎ ｓ ｔ ｒ ｕ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｒ ｅ ｃ ｏ ｍｂ ｉ ｎ ａ ｎ ｔ ｐ ｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｓ ｐ ＥＴ２ ８ ａ － ｓ ｏ ｘ
百度文库
度为 ２ ． ０ 、 ２ ０ 、 １ ０ ０ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ ，分别 混 匀在 ３ ７℃水 浴 中 保温 ２ ． ５ ｈ ， 测 定各 组 酶活力 。以未 加入 金属 离子 的 酶液 的活性 为 １ ０ ０ ％， 计 算 各组 的相对 酶 活力 ， 以观
察金 属离 子对 酶活 性 的影 响 。
以肌氨 酸 为底 物 ， 参 照文 献 方法 测 定［ １ ３ １ ． 取
５ ０ Ｌ不 同浓 度 的 Ｓ Ｏ Ｘ酶 液 ，分别 加 入 ３ ｍ Ｌ显 色
１ ． ７ ． ５ Ｓ Ｏ Ｘ 酶 动 力 学 参 数 的 测 定 用 ｐ Ｈ ８ ． ０的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ 缓 冲液配制浓度分别 为 １ ． ０ 、 ２ ． ０ 、 ３ ． ０ 、 ４ ． ０ 、 ５ ． ０ 、 ６ ． ０ 、 ７ ． ０ 、 ８ ． ０ 、 ９ ． ０ 、 １ ０ ． ０ ｍ ｍｏ ｌ ／ Ｌ的肌 氨 酸 溶 液 。 于
照 文献 ［ １ ４ １ ， 纯化后 的酶液 置于 ４℃保存 备用 。
ｇ ｅ ｎ ｅ ｏ ｆ Ｓ Ｏ Ｘ （ １ １ ６ ４ ｂ ｐ ）
１ ． ７ ． ２ 酶 的 最适反 应 温度 和 最适 ｐ Ｈ 值 的测 定
在
ｐ Ｈ ８ ． ０ 、 ２ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ 缓 冲液 体 系 中 ，在 ２ ０ ～ ８ ０℃范 围 内测 定 不 同温度 下 的酶 活 力 ， 观察温 度 对 酶 活性 的影 响 ． 以 确定 酶 的最 适 反 应 温 度 ： 在不 同 ｐ Ｈ的反 应体 系 （ ｐ Ｈ ４ ． ０ ～ ｌ １ ． Ｏ ） 中测 定 Ｓ Ｏ Ｘ 的酶 活 力． 以酶 活力 最 高 的记 为 １ ０ ０ ％， 计算其他 ｐ Ｈ 条 件 下 的相 对酶 活 力 ，确 定 酶促 反 应 的 最适 ｐ Ｈ。不 同
别 置 于一 系列 不 同 ｐ Ｈ 的缓 冲液 中 ． ３ ７℃放置 ２ ． ５ ｈ
含 Ｋａ ｎ的 Ｌ Ｂ液 体 培养 基 中 ．于 ３ ７ ｃ Ｉ 二 ２ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ振 荡 至菌 体浓 度 Ｏ Ｄ 鲫 约为 ０ ． ６ — ０ ． ８ ， 加入 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ达 到终 浓度为 １ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ进行诱导 ， 继续培养 ８ ｈ 。 ８ ０ ０ ０ ｒ ／ ｍ ｉ ｎ ，
ｐ Ｈ的缓冲液体 系为柠檬酸一 柠檬酸钠缓 冲液 （ ｐ Ｈ ４ ． Ｏ 一 ５ ． Ｏ ） ，磷 酸 一 磷酸 钾 缓 冲液 （ ｐ Ｈ ６ ． ０ ～ ７ ． ０ ） ， Ｔ ｒ ｉ ｓ —
ｐ ＢＲ ３ ２ ２ ｏ ｒ ｌ
Ｈ Ｃ １ 缓冲液 （ ｐ Ｈ ８ ． ０ ～ ９ ． ０ ） ， 碳酸氢钠一 Ｎ ａ Ｏ Ｈ 缓 冲液
数 ５ ％的 接 种 量 接 入 发 酵 培 养 基 ， ３ ７℃ ， ２ ０ ０ ｒ ／ ａｉ ｒ ｎ 培 养至 Ｏ Ｄ ６ ０ ０ ０ ． ６ ～ ０ ． ８后 ，采 用 １ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ的 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱
导８ ｈ 。菌 液破 壁 离心 后 。 取 酶上 清 液进 行 纯 化 ， 参
Ｓ Ｄ Ｓ — Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶 电泳 鉴定 。
１ ． ６ 肌 氨 酸 氧 化 酶 酶 活 测 定
应 体 系 中分 别 加 入 不 同 的 金 属 离 子 Ｎ ａ 、 Ｋ 、 Ｃ ａ 、
Ｍｇ ２ ￣ ， ＭＲ ２ ＋Ｆ ｅ ３ ＋ 、 Ｃ ｏ 、 Ｃ ｕ 和 Ｚ ｎ ２ ＋ ， 设 置 ３个 终浓 度 梯
后， 测 定其 对 应 的剩余 酶 活力 ， 以观察 酶 的 ｐ Ｈ稳 定 性 。不 同 ｐ Ｈ 的缓 冲液体 系 同 １ ． ７ ． ２ 。
１ ． ７ ． ４ 金 属 离子 对 酶 活 力影 响 的 测 定 在 不 同 反
４℃离 心 ５ ｍｉ ｎ收 集菌 体 ，用 ２ ０ ｍｍ ｏ ｌ ／ Ｌ ｐ Ｈ ８ ． ０的 Ｔ ｒ ｉ ｓ — ＨＣ １ 缓 冲 液洗 涤 悬 浮 菌体 ， 冰 水浴 超 声 破 碎菌 体， 获 得待 测酶 液 。同时 以不加 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导 的重 组 菌 和 一个经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ诱 导 的 非 重 组 菌 作 为 对 照 ，进 行