修饰动物模型的建立及应用

Normal Sampl e
2. Label
3. Mix with labeled reference DNA 4. Hybridize to Chip
5. Wash and Image
Expression
1. Extract mRNA from tissue
2. Produce cDNA by RT & Label
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目5 录
核酸分子杂交的杂交动力学 核酸分子杂交
核心序列形成 自发过程
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目6 录
（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe)
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目7 录
探针的来源
基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
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目8 录
二、印迹技术的类别及应用
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting)
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2目6 录
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2目7 录
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2目8 录
Research UΒιβλιοθήκη Baidue—— From Sequence to function
计算Ratio 值 (= Cy3/Cy5)
在 0.5-2.0 之外的定义为在两样本中 有明显差异表达。进而获取初步功能信 息。
Clustering
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2目9 录
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1目0 录
核酸杂交技术 （一）Southern Blot 原理
用途：检测样品中的DNA及其含量， 了解基因的状态, 如是否有点突变、 扩增重排等。
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1目1 录
Southern Blot 操作步骤：
DNA 琼脂糖电泳 印迹转移 预杂交 杂交（变性探针） 洗膜 放射自显影或显色
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目2 录
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization )
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目3 录
复性
RNA
DNA
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目4 录
核酸分子杂交的原理
带有某种标记的核酸单链作为探针， 在一定条件下， 按碱基互补配对原 则与互补的核酸单链退火形成双链 杂交体， 鉴定靶序列的存在、分子 大小或进行靶序列的相对定量分析。
1目7 录
Hours 0 4 8 16
Western blot analysis of the cleavage of Caspase-3/Bcl-2. Cells were treated with 20M of gossypol for 4, 8 and 16 h. After treatment, cells were harvested and lysed in lysis buffer. 50ug of protein was loaded in each lane and the expression of actin was detected as a loading control.
芯片杂交结果示意图
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3目0 录
DNA 点阵
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3目目1 录录
DNA芯片技术的主要应用
① 分析基因组、发现新基因 ② 基因表达的研究 ③ DNA序列分析 ④ 基因诊断 ⑤ 基因药物设计
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3目2 录
第二节
聚合酶链反应
Polymerase Chain Reaction
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3目3 录
DNA芯片
DNA芯片: （Bio-chip、DNA arrays、 Oligonucleotide microchip)
特点：高度并行性，多样性，微型化和 自动化。
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2目4 录
Assay Formats
Genomic
1. Extract genomic Tumor DNA from tissue Sample
1969, Pardue --爪蟾核糖体基因探针 1970, Orth ---兔乳头状瘤病毒cDNA 探针
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1目5 录
Western Blot 原理
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1目6 录
操作过程
SDS-PAGE电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜）
封闭
一抗 洗涤
酶标二抗反应
洗涤 显色或化学发光显影
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1目2 录
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1目3 录
斑点印迹杂交(Dot blot)
斑点印迹 优点-----简单、迅速；核酸粗提、多样品检测 缺点-----不确定分子量、特异性不高，假阳性
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1目4 录
原位杂交 （In Situ hybridization） 标记的核酸探针与组织切片或细胞中的 待测核酸中的互补序列杂交。
PCR技术发展简史
(1)PCR的最早设想 (2)PCR的实现 1985年美国PE-Cetus公司人类遗传 研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶 链反应。 (3) PCR的改进与完善
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3目4 录
耐热的DNA聚合酶
Taq DNA聚合酶于1988年saiki从嗜热水生菌 thermus aquatics YT-1株中直接分离出来。
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1目8 录
注意的问题
蛋白质电泳 常用SDS-PAGE 非变性PAGE Tris-Tricine胶中电泳
聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套
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1目9 录
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三 种 印 迹 技 术 的 比 较
2目0 录
②
①
③
分子杂交实验
目录
放 射 自 显 影 照 片
目录
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2目3 录
第二十二章
常用分子生物学技术 的原理及应用
The Popular Technology in Molecular Biology: Principle and Application
生物科学与技术学院
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目1 录
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
（二）RNA印迹技术 (Northern blotting)
（三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
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目9 录
其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array) DNA芯片技术 (DNA chip)
3. Mix with labeled reference cDNA
4. Hybridize to Chip
5. Wash and Image
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2目5 录
DNA micrarray robot enclosed in a temperature and humidity controlled environment.